|
遺伝子治療用ベクターとしてヒトサイトメガロウイルス(HCMV)を用いる場合には、正常な細胞では増殖できないように改変する必要がある。そのためにウイルスの感染・増殖にもっとも重要であると思われてるIE1遺伝子を欠損したウイルスの構築を試みた。このためにはIE1を恒久的に発現しかつHCMVが感染増殖できる細胞株が必要となる。従来報告されているHCMVが感染増殖できる細胞株について検討を行ったところ、ウイルスの産生量の低さ等の問題で実用的ではないことが判明した。このためHCMVの感染用細胞として用いられてるHEL細胞をSV40によって不死化した細胞のうち、感染・増殖効率のよい株を分離して実験に用いた。これにIE1遺伝子とマーカー遺伝子としてneo遺伝子の入ったプラスミッドをトランスフェクションし、G418でセレクションを行い数十個のコロニーを拾った。蛍光抗体法でIE1産生量の多いコロニーのセレクションを行った。得られた細胞株HIE1を用いて組換えウイルスの構築を行った。
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)DAN1μgと1E遺伝子のエクソン4領域にlacZを挿入したプラスミッド1μgをHIE1にコートランスフェクションして、アガロースをオーバーレイした。約3週間後に出現したプラーク中Xgalで青く染まるプラークをピックアップしさらに2回プラークアイソレーションを行った。得られた組換えウイルスVMIE1についてIE1の欠損をPCRとハイブリダイゼーションで確認した。
VMIE1をMOI2でHEL細胞に感染させたところ、親株のTowne株と同様の増殖を示した。また感染細胞中には蛍光免疫染色でIE1の発現は認められなかったことから少なくともIE1はin vitroでは必要でないことが判明した。このためIE1欠損ウイルスは遺伝子治療用ベクターとしては不適格であると判断した。今後、IE2欠損ウイルス、IE1&2欠損ウイルスについても検討を行う予定である。
|
