| 研究概要 |
ウイルスのcDNAから感染性ウイルスを回収するためには活性を持ったRNA合成に関与するタンパク質(L,P,NP)の発現が必須である。本年はクローン化したL,P,NP遺伝子の機能を見るため、cDNAよりワクチニアーT7発現システムを用いてタンパク質を発現させ、ムンプスウイルス感染細胞より単離したRNPを鋳型として何度かin vitroでRNA合成を試みたが、残念ながら標識されたRNA転写産物ならびに複製産物を検出することは出来なかった。またCAT(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ)遺伝子を持つミニレプリコンをin vitroで作製し、ミニレプリコンの複製をCAT活性を指標とし、ワクチニアウイルスの増殖を阻害するリファンピシン、AraC存在下で追跡することを試みたがこちらも残念ながらCAT活性を検出することは出来なかった。原因のひとつとしてクローン化したcDNAに変異が入り、そのために活性のあるタンパク質が出来ていないことが考えられた。我々の得たcDNAからは分子量的、抗原的、さらに複合体形成からみても本来のものと変わらないタンパク質が発現されたが、ひとつのアミノ酸変異により活性が失われることもあり得る。実際、我々の得たcDNAクローンのなかには塩基置換を持つcDNAクローンが含まれており、どちらが正しいか判断するのは難しい。この問題を解決するため、DNAシークエンサーによりウイルスRNAから得たRT-PCR産物の塩基配列をダイレクトに決定することによりメジャーなRNAポピュレーションの塩基配列を決定しつつある。同時に構築したcDNAに誤りがないか、同じ方法を用いて調べている。現在までに約半分の塩基配列を確認した。今後、L,P,NPについてはこの方法ですべて確認する予定である。
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