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A.Perforinの肝組織中発現量測定系の基礎的検討
RT-PCRにて肝組織中perforin-mRNAの定量系の確立を目指して条件設定を行った。欠質を有するpeforin-cDNAを作製しinternal controlとして用いperforin-mRNAのRT productおよびinternal controlのcDNAの増幅をPCRを用いて行った。増幅されるmRNAとcontrol cRNAは欠質部分だけ長さが異なり増幅効率に差が生じるため検量線を作製し、同時に再現性の検討も行った。検出は増幅PCR産物を蛍光色素で標識し373DNAseuqencer+GeneScanTMにて解析を行った。
B.Perforin発現の肝組織内局在の基礎的検討
perforin-mRNAのin situ hybridizationの確立を目指してRNAprobe作製および条件設定を試みたが、perfoin-mRNAの発現量が少なくdigoxigenin標識cRNAによるin situ hybridizationでは検出し得なかった。現在、in situ PCRを試みている。さらに、perforin発現細胞の同定を行うため、連続切片を用いてリンパ球表面マーカーを用いた免疫組織染色を行った。また、perforin発現細胞とHCV感染肝細胞との関連を検討するため、やはり連続切片を用いてHCV-RNAのin situ hybridizationをPCR-labelingにより作製したdigoxigenin標識cDNAを用いて行った。
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