| 研究課題/領域番号 |
07671306
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
合地 明 岡山大学, 医学部・附属病院, 助手 (10186877)
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| 研究分担者 |
松原 長秀 岡山大学, 医学部・附属病院, 医員
清水 憲二 岡山大学, 医学部, 教授 (10037286)
田中 紀章 岡山大学, 医学部, 助教授 (10127566)
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| キーワード | 大腸癌 / ornihine decarboxylase (0DC) / 癌悪性化機構 / 遺伝子不安定化 / 遺伝子複製異常 |
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| 研究概要 |
当科で行われた手術切除標本の癌部、非癌部の凍結標本バンクをもとにtotal RNA,DNAの抽出を行っている。原則として、tRNAを用いてoncogeneのcoding全領域をRT-long PCRにより増幅し、これを制限酵素で切ってSSCP解析を行ってきている。とれたcDNAはcloningし、clone、RT-PCR ptoduct、genomic DNAを材料に、ABIオートシーケンサーによる遺伝子配列の決定を行っており、mutationの検出およびその確認には重複確認を原則とし慎重を期している。その結果、新たなmutationの検出がなされるようになってきた。
その一つとして、大腸癌において、ODC(ornithine decarboxylase)のcoding regionにいくつかのmissense mutationが存在が見つかってきた。しかし、一部まだ確認作業中のため、および、発現実験が残っているため、発表は差し控えている。
方法の概要は以下のとおりである。coding領域を含むExon 3からExon 12をカバーするprimer pairを設計した。つまり、5'priner-GCACACGCAG-AGGGATTTGGAAおよび 3"primer-ATC ATGGCGACCCTACTCTTACA を用いて、1610bpのrt-PCR産物を得た。これをNde I and Ban Iで切り、変成させた切断DNA断片をポリアクリルアミドゲルに泳動した。同一癌患者の正常組織と癌組織よりのsampleで、泳動パターンに変化のあったものついて、ODC rt-PCR fragmentをpBSKS(-)のEcoR IとHinc IIのunique siteにdirect orientedにcloningした。さらにcodingl領域の内側にいくつかのsequence用のprimerをつくり、5'側3'側の両方より、ABIオートシーケンサーにより遺伝子配列を決定した。異常の見られた配列については、rt-PCR産物のdirect sequenceによる確認を行い、さらに、genomic DNAをdirect sequenceし、現在最終確認している。異常のあったクローンについてNIN3T3細胞にtransfectionして、transform能を見ようとしているところである。
一方、遺伝子不安定化の指標としてmutator geneの影響を受けるmicrosatellite instabilityについては、片方のprimerを蛍光色素でラベルしたprimerを設計し、ABIのオートシーケンサーを使って、様々な消火器癌でのreprication error(RER)検索をおこなった。われわれの仮説に基づきODC mutationとRER phenotypeとの関係を現在検討中である。
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