| 研究課題/領域番号 |
07671598
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
松本 智子 長崎大学, 医学部, 助手 (30239107)
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| 研究分担者 |
山下 俊一 長崎大学, 医学部, 教授 (30200679)
岩崎 勝郎 長崎大学, 医学部, 教授 (60039542)
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| キーワード | TGF β receptor / chondrocyte / two-hybrid cloning |
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| 研究概要 |
TGF-βは関節軟骨の主要な増殖、分化促進因子であるが、その作用機序は軟骨細胞はもとより一般の上皮系細胞においても依然不明である。我々は培養ラット関節軟骨細胞がTGF-βで著明に細胞増殖を促進することから、TGF-βの情報伝達経路を解析するにあたり、非常に有用なモデルと考えている。そこでTGF-βIもしくはII型レセプターに結合し、情報伝達に関与していると考えられる介在蛋白のクローニングを、in vivoに近い条件下で検出可能なtwo hybrid system法で試みている。
まず、酵母の転写因子であるGAL4のGAL1プロモーターへの結合蛋白との融合蛋白を作製すべく、TGF-βのI型とII型レセプターの細胞内ドメインをPCR法で取りだし、GAL4転写因子のDNA結合ドメインを発現するプラスミドベクターのDNA結合ドメインの下流に組み込んだ。これをダイレクトシークエンスでフレイムが合致していることを確認した。そして培養ラット関節軟骨細胞からcDNAを合成し、GAL4の活性化ドメインを有するプラスミドの下流にサイドダイレクショナルに組込み、4×10^6個の独立コロニーからなるライブラリーを作成した。そしてこれらをトリプトファン、ロイシン、ヒスチジン要求株の分裂酵母株HF7Cに遺伝子導入し、上記アミノ酸を欠損させた培地で選択し、かつβガラクトシダーゼ活性を測定することでスクリーニングを行なった。その結果、TGF-βのI型およびII型レセプターに結合するクローンとしてそれぞれ3個、12個単離することができた。現在得られたクローンが真のそれかどうかを確認するためベクターを入れ換えたり、他の酵母株SFYを用いることで検討中である。
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