| 研究課題/領域番号 |
07671599
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
小田 純爾 長崎大学, 医学部, 助手 (30253644)
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| 研究分担者 |
大津留 晶 長崎大学, 医学部, 助手 (00233198)
岩崎 勝郎 長崎大学, 医学部, 教授 (60039542)
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| キーワード | PTHrP / chondrocyte / cloning |
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| 研究概要 |
培養ラット関節軟骨細胞に対する種々のPTHrPフラグメントを用いた添加実験、発現ベクターによる過剰発現、そしてアンチセンスオリゴヌクレオチドによる抑制実験から我々は、PTHrPのC端に軟骨細胞特異的な生理活性部位が存在するとともに、それに対応したレセプターが発現している可能性があると推定している(投稿中)。そこで軟骨特異的PTHrP受容体をクローニングすべく、発現クローニング法を用い、現在まで研究を行なってきた。
まず培養ラット関節軟骨細胞からtotal RNAを抽出し、オリゴdTカラムでメッセンジャーRNAを分離し、オリゴdTプラーマ-でcDNAを合成した。これをλZAPIIに組込み、in vitro packagingで発現ベクターを作成した。得られたindependent colony数は4×10^5個である。これをCOS細胞、NIH3T3細胞にリポゾーム法で遺伝子導入させ、蛋白を発現させた。そしてクロラミンT法で^<125>Iをラベルした各種のPTHrPのC端フラグメントを添加することで、結合する細胞の同定を試みている。これまで、PTHrPの35-60,60-80の合成フラグメントでスクリーニングを行なったが、これらのフラグメントでは今のところ、明らかなポジティブクローンを得る事は出来なかった。今後、上記以外のフラグメントを用い、引き続きスクリーニングを行なう予定である。しかし、ポジティブクローンが得られなかった理由に、細胞種の違いによる遺伝子導入の効率や翻訳後修飾の可能性もあり、上記細胞以外に、Hela細胞、SAOS細胞等でも同様に行なう予定である。またPTHrPフラグメントのレセプターに対する結合能が弱いがための可能性もあり、その対策として架橋剤を使用すべく、現在検討中である。
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