| 研究概要 |
子宮頚癌培養細胞Hela、子宮内膜癌培養細胞Ishikawa,卵巣癌培養細胞2780よりRT-PCRで全open reading frameを含むfull lengthのp16INK4 cDNA, p21WAF1cDNAを作製し、TA-cloning vector pCRIITMに組み込んだ。Sequence解析でIshikawa, Helaはp16INK4はWilt type, p21WAF1はcodon 31に点突然変異が確認された。しかしp16INK4には遺伝子変異は観察されなかった。これらは共にp16INK4のmRNAはNorthern blottingでは明らかに発現が観察された。一方p21WAF1の発現量はWestern blotting, Northern blottingで弱い発現が見られた。Hela細胞2780にpMAMneoにWild type p21WAF1、p16INK4を組み込み遺伝子導入した。遺伝子導入した細胞のうち2780, Hela細胞にexogenous wild type p21WAF1の強発現が観察され、これらの細胞亜株では発現量に応じた細胞増殖抑制が観察された。しかしp16INK4はmRNAレベルで発現量の増加は観察できなかった。
次にp21WAF1、p16INK4遺伝子をretoviral vector pXT1にSubcloningしecotropic packaging cell line E86にtransfectionし次いでamphotropic packaging cell line Am12に感染させた。G418で耐性株を選択し遺伝子組み替えretrovirusを作製した。
Hela細胞、2780細胞からp21WAF1高発現株を得た。これらは明らかな増殖能の低下、Anchorage-independent増殖能の低下、ならびにTelomerase活性の低下がみられた。したがってp21WAF1蛋白質には形質変換した細胞に対して分化を誘導するとともに、不死化した癌細胞を可死化する作用を有することが判明した。
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