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破骨細胞ではNO生成薬物によって骨分解活性が低下することが観察されており、破骨作用の制御にたいして細胞内の一酸化窒素合成酵素(NOS)が重要な働きをすると考えられる。NOSは一種のモノオキシゲナーゼで、L-アルギニンからNOを生産する際に、分子状酸素(O_2)、NADPHおよび補酵素テトラヒドロビオプテリン(BH4)を必要とする。BH4による破骨細胞NOSの活性化機構の一環として破骨細胞内NOSの生合成とBH4合成酵素系の活性および細胞内局在などの相関性を検索するために、BH4合成酵素のクローニングを行い、そのexpressionにより酵素タンパク質を多量に収得をこころみ、それらの性状を調べた。まずBH4生合成系の最終段階に働き直接BH4の生産にたずさわるセピアプテリン還元酵素(SPR)のクローニングを行った。SPRは分子量56kDaで28kDaのサブユニットのhomodimerである。今回ヒトSPR及びラットSPRのcDNAを既報の塩基配列をもとに各々4種のプライマーを作成し、RT-PCR法で増幅して得た。得られたcDNAの塩基配列を確認し、SPR cDNAをVector(ヒトではpET 16b、ラットではpET 29aを用いた)に導入して、大腸菌[BL21 (DE3) PLYS]で発現させた。その結果いずれもSPR活性をもったタンパクとして収得できた。又発現SPRタンパク質はnative enzymeと同様に、Ca^<2+>/Calmodulin-dependent protein kinase IIおよびprotein kinase Cによってリン酸化されること およびm-Calpain sensitiveであることを確認した。更に得られた各発現タンパク質をウサギをもちいて抗体を作成した。これらの成果は今後NorthernあるいはWestern blott法による破骨細胞内BH4合成系の検出のために有効であると思われる。
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