キラルエドマン法の開発とD, L-アミノ酸配列分析システムの構築

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07672321
• 研究機関: 静岡県立大学
• 研究代表者: 豊岡 利正 静岡県立大学, 薬学部, 教授 (40183496)
• キーワード: 光学活性蛍光標識化試薬 / D / L-アミノ酸分析 / キラルエドマン法 / ペプチド / ジアステレオマ- / 蛍光分析 / 液体クロマトグラフィー

研究概要

多くの微量の生理活性ペプチド類が医薬品として疾病の治療に供されている。しかし天然型ペプチドは医薬品としての安定性が不十分であったり、副作用が強い等の問題があることがある。これらの欠点を補うために天然型のペプチド中のアミノ酸の一部をD-体に置換した生理活性ペプチドアナログを医薬品として開発することが試みられている。また近年、我々の体内にも幾つかのD-アミノ酸が存在することが明らかとなり、疾病との関連性や生理的な意義が検討され始めている。このような背景から、D/L-アミノ酸の高感度分離分析法の開発やペプチドのD/L-アミノ酸を識別するキラルエドマン法の確立が重要である。
我々は光学活性蛍光標識化試薬(DBD-PyNCS, NBD-PyNCSのR、S-体の4種類)を新規合成し、最適反応条件および標識化D/L-アミノ酸のジアステレオマ-のHPLC-蛍光検出法による高感度一斉分析法を検討し、グルタミン酸、シスチンを除く16種のD/L-アミノ酸の分離分析を可能にした。標識化アミノ酸の検出限界は数十フェムトモルと高感度であり生体内の微量のD-アミノ酸の検出に有効である。一方本試薬を用いたペプチドのD/L-アミノ酸配列分析法を検討した。カルバモイル誘導体からチオヒダントイン誘導体への環化反応のラセミ化率はアミノ酸の種類によりことなるものの、20%弱であり、D-体あるいはL-体の識別には問題なく本法によるキラルエドマン法は十分適用可能であるものと判断し、D-アミノ酸含有生理活性ペプチドのエンケファリンやデルトルフィンIIなどの配列分析に応用した。しかし、これまでのところ一部のアミノ酸のチオヒダントイン誘導体の分離が不十分であり、本法の汎用性を高めるためにこれらの分離を検討している。

研究成果

• [文献書誌] T. Toyooka, Y. -M. Liu: "Development of Optically Active Fluorescent ″Edman-type″ Reagents." Analyst. 120. 385-390 (1995)
• [文献書誌] T. Toyooka, Y. -M. Liu: "Resolution of Amino Acid Enantiomers by HPLC with Fluorescent Chiral Edman Reagents." Journal of Chromatography A. 689. 23-30 (1995)
• [文献書誌] T. Toyooka, Y. -M. Liu: "Determination of D- and L- Amino Acid Residues in Peptides with Fluorescent Chiral Tagging Reagents by HPLC." Chromatographia. 40. 645-651 (1995)
• [文献書誌] Y. -M. Liu, et al.: "Enantiomeric Separation of Di- and Tripeptides with Chiral Fluorescence Labelling Reagents by Liquid Chromatography." Analytical Chimica Acta. 314. 169-173 (1995)
• [文献書誌] T. Toyooka, et al.: "Sequential Analysis of D/L-Amino Acid in Peptide with a Novel Chiral Edman Degradation Method." Analytical Sciences. 12. 779-782 (1996)
• [文献書誌] T. Suzuki, et al.: "Determination of D/L-Amino Acid in Peptide Sequences Based on Fluorescent Chiral Derivatization by Reversed-phase Liquid Chromatography." Analytical Chimica Acta. (in press). (1997)