| 研究概要 |
1.ラットスペルミジン合成酵素のアミノ酸配列と活性部位に位置すると思われる遊離SH基の検索:ヒト,マウス,ラットについてcDNAに基づくスペルミジン合成酵素の一次構造が知られているが,ラット由来酵素のそれが他と大幅に違っていたため,実際の酵素タンパクを用いて一次構造を調べてきた.これまではリジルエンドペプチダーゼによる限定加水分解とエドマン法を組み合わせて行ってきたが,さらにアルギニルエンドペプチダーゼによる限定加水分解および2-ニトロー5-チオシアノ安息香酸を用いるシステイン残基のN端側での選択的な化学的開裂法とTOF-MASを組み合わせて,ほぼその全容を知ることができた.その結果,N末端はアセチル化されており,11番目のアミノ酸がプロリンであることを除けば,他の全ての配列がマウスのcDNAから得られたものと一致していることがほぼ判明した.なお,活性部位の遊離SH基に関する新たな情報は得られていないが,酵素の失活を防ぐためのジチオスレイトールの代わりに,SH基を持たない還元剤,トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)の利用が可能であった.これは今後種々のSH試薬と酵素との反応を直接調べるために大いに役立つと考えている.
2.スペルミジン合成酵素の遊離SH基周辺アミノ酸配列の空間的位置関係を調べるための二機能性SH試薬:試薬としては4-アジド-ヨードアセタミドベンゼンを合成したが,水に難溶性でSH基以外のアミノ酸残基とも反応するため未だ実際に適用していない.これまでは活性部位内の複数のSH基を想定して,それらのSH基間に橋渡しできるような二機能性試薬を考えてきたが,今後はそれにこだわらずに,タンパク分子内で架橋できれば一次構造の折り畳み状況を知る上で重要な情報になるとの考えで研究を進めている.一連の二機能性試薬としては,メチルグリオキザ-ル,マロンジアルデヒドを選び検討中である.
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