IgG型抗TSH受容体自己抗体遺伝子の解析とその応用

1995 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07672487
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 赤水 尚史 京都大学, 医学研究科, 助手 (20231813)
• 研究分担者: 小杉 眞司 京都大学, 医学研究科, 助手 (50252432) ; 松田 文彦 京都大学, 遺伝子実験施設, 助手 (50212220) ; 須川 秀夫 京都大学, 医学研究科, 講師 (70162857)
• キーワード: 免疫グロブリン遺伝子 / TSHレセプター / 抗TSHレセプター抗体 / バセドウ病 / 原発性甲状腺機能低下症

研究概要

バセドウ病や機能低下症の一部では抗TSHレセプター抗体が発症や病態形成に直接的に関与することから、同抗体の構造や機能に関する研究は非常に重要である。最近我々は、バセドウ病及び原発性甲状腺機能低下症患者から多数のモノクローナルTSHレセプター抗体産生リンパ球をクローニングし、同リンパ球から免疫グロブリン遺伝子を単離・解析しており、同抗体の一次構造を明かにしつつある。ただし、これまでの得られたモノクローナル抗体の多くはIgMであつた。しかしながら、患者血中に存在する自己抗体の多くはほとんどIgGであるので、今回はIgG型抗体も得ることができるシステムを用いて研究を行なつた。
1)抗TSH受容体抗体遺伝子の一次構造の決定:バセドウ病または甲状腺機能低下症患者の末梢血からリンパ球を分離した後、MACS法にて、IgGを表面に有するBリンパ球を濃縮精製した。次いで、EB virusでtransformする。これによつて、IgG産生型Bリンパ球のクローニングを容易にした。培養上清に対して抗TSH受容体抗体アツセイ(TBII, TSAb, TSBAb法)を行い、陽性クローンを得た。得られたTSH受容体抗体産生B細胞クローンからmRNAを抽出し、逆転写酵素にてcDNAを合成した。免疫グロブリン遺伝子に特異的なプライマーを用いて、PCR法にて重鎖と軽鎖のそれぞれの遺伝子を単離し、核酸シークエンスの解析をした。最終的には、4つのTSAb陽性クローンから免疫グロブリン遺伝子が得られた。その結果、使用されている可変遺伝子部位に限定が示唆され、体突然変異が抗体活性に重要であることが示された。
2)モノクローナル抗TSHレセプター抗体の再構成とその応用:単離した免疫グロブリン遺伝子を発現ベクターに組み込んで、リコンビナント抗体作製も試みている。

研究成果

• [文献書誌] Li H, Akamizu T, Okuda, Mori T J, Sugawa H, Matsuda F, Tsubata T: "Isolation of Epstein-Barr virustransformed Lymphocytes producing IgG class monoclonal antibodies using a Magnetic Cell Separator (MACS)" Biochem Biophys Res Commun. 207. 985-993 (1995)
• [文献書誌] Akamizu T, Ueda Y, Li H, Okuda J, Mori T: "Establishment of an antihuman thyrotropin receptor(TSHR) specific CD4+ T cell line from a patient with Graves' disease." Thyroid. 5. 259-264 (1995)
• [文献書誌] Akamizu T, Kohn LD, Mori T.: "Molecular studies on TSH receptor and anti-TSH receptor antibodies." Endocrine J.42. 617-627 (1995)
• [文献書誌] Akamizu T, Okuda J, Sugawa H, Matsuda F.: "Isolation of Lymphocytes producing human IgG class monoclonal TSAb and analysis of variable regions of their Ig genes." 11th International Thyroid Congress(abstract). S-129 (1995)
• [文献書誌] Okuda J, Akamizu T, Matsuda F.: "Variable regions of immunoglobulin genes encoding “blocking type" antithyrotropin receptor antibodies of patients with primary myxedema." 11th International Thyroid Congress(abstract). S-210 (1995)
• [文献書誌] 赤水尚史: "Modern Physician 抗TSHレセプター自己抗体遺伝子の解析." 3 (1995)