| 研究課題/領域番号 |
07680574
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
酒井 一夫 東京大学, 医学部(医), 講師 (40153837)
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| 研究分担者 |
平野 和也 東京大学, 医学部(医), 助手 (80251221)
伊藤 正光 東京大学, 医学部(医), 助手 (80176362)
鈴木 紀夫 東京大学, 医学部(医), 教授 (10010050)
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| キーワード | 温熱感受性 / 温熱抵抗性 / 細胞融合 / 遺伝子クローニング / 色素排除試験 / DNAラダー |
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| 研究概要 |
チャイニーズハムスターV79細胞(温熱高感受性)とヒトグリオーマA7(温熱抵抗性)の融合細胞のうち、A7に近い抵抗性を示すクローン(VA41-4)を材料として温熱抵抗性遺伝子の単離へ向け作業を進めた。
VA41-4に含まれるヒト遺伝子のうち、温熱抵抗性決定に関与するものを絞り込む目的で、VA41-4よりDNAを抽出し、薬剤耐性(G418耐性)マーカー遺伝子とともにV79に導入した。G418処理で、外来DNAを受け入れた細胞を選択した後、温熱処理を繰り返し、温熱抵抗性形質転換細胞4株を分離した。このうち1株はVA41-4と同様の抵抗性を示し、3株はVA41-4とV79の中間の抵抗性を示した。前者より、単クローン温熱抵抗性形質転換細胞株としてI-41が得られた。
I-41よりDNAを抽出し、λファージベクターEMBL4を用いてゲノムライブラリーを作製した。このライブラリーの中に、約5x10^<-4>の頻度でヒト反復配列を持つファージクローンが確認された。現在、得られたクローンをプラズミドにサブクローニングして、I-41のcDNAライブラリーを検索するためのプローブを調製している。
一方、温熱抵抗性遺伝子の機能を探る目的で、V79とA7の温熱処理に対する応答の違いを検討した。コロニー形成法で同程度の致死効果(生存率10^<-3>)を与える処理の後の死細胞の出現の時間経過を色素排除法で調べたところ、V79では処理後数時間で死細胞が出現するのに対し、A7では40時間目以降であった。
また、同処理後のDNAの断片化についても検討したが、V79では温熱処理直後からヌクレオソーム単位の断片化(DNAラダー)が観察されたのに対し、A7では処理後160時間まで経過を追ったが、ラダーの出現は認められなかった。
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