カブトガニ血球の貯蔵顆粒内タンパク質のプロセシングと貯蔵顆粒の形成機構

1995 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07680693
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 川畑 俊一郎 九州大学, 理学部, 助手 (90183037)
• 研究分担者: 牟田 達史 九州大学, 理学部, 助手 (60222337)
• キーワード: Kex2 / Subtilisin / Furin

研究概要

カブトガニの血球細胞には密度の異なる大小2種類の分泌顆粒が存在し、その中に体液凝固因子や抗菌物質などが多数含まれている。これらのタンパク質のうち、R-X-R-RもしくはR-X-K-Rの部位でプロセシングを受けて成熟型に変換されるものが少なくとも5種類見い出されており、Kex-2-likeプロテアーゼの存在が示唆された。今回、日本産カブトガニ血球由来Kex-2-likeプロテアーゼの全構造を明らかにする目的で、cDNAクローニングを行った。既知のKex-2-likeプロテアーゼ間で高く保存されている領域をもとにPCR法でプローブを作成し、血球cDNAライブラリーを用いてスクリーニングを行い、約2.5kbpのクローンについて塩基配列を決定した。その結果、全長は2557bpであり、752アミノ酸残基からなるタンパク質をコードしていた(limulus subtilisin-related proprotein convertase ; L-SPCと命名)。L-SPCはKex-2-likeプロテアーゼ特有のサチライシン様触媒領域を有し、ショウジョウバエfurinの触媒領域と最も高いホモロジー(80%)を示した。しかし、L-SPC分子は、furinのC末端側に存在するCys-rich領域は無く、かわりにKex 2に見られるSer/Thr-rich領域が存在した。また、Kex 2やfurinに特有の膜貫通領域と考えられる領域がC末端側に見い出されたが、cytoplasmic tailと予想される領域は無く、その細胞内局在性に興味が持たれた。また、血球、心臓、肝膵臓、胃、腸、骨格筋のpoly A^<(+)> RNAを用いて、Northern blottingを行った結果、L-SPCは血球で特異的に発現していることが明らかになった。このことから、L-SPCが血球顆粒内タンパク質をプロセシングしている可能性が示唆された。次に、L-SPCのN末端側42アミノ酸残基(成熟タンパク質の1-42)とC末端側69アミノ酸残基(545-613)を、それぞれGST融合型でE. coliを用いて発現させ、それらを抗原としてポリクローナル抗体を作成した。得られた抗体は、COS細胞を用いて発現させたフルレングスのL-SPCに対しても反応性が得られた。そこで、この抗体を用いてL-SPCを発現しているCOS細胞を免疫沈降し、Western blottingを行ったところ、L-SPCは還元状態で分子量約110,000の糖タンパク質であることが明らかになった。また、同様の細胞を用いて免疫蛍光染色を行った結果、L-SPCはゴルジ体に局在することが明らかになった。

研究成果

• [文献書誌] Tetsu Saito: "Isolation, amino acid sequence snd antibacterial activity" Journal of Biochemistry. 117. 1131-1137 (1995)
• [文献書誌] Tetsu Saito: "Purification, primary structure and antibacterial activity" Journal of Biochemistry. 270. 14493-14499 (1995)
• [文献書誌] Kengo Fujimoto: "Nucleotide sequence of the prophenoloxidase A1 of Drosophila melanogaster" Proceedings of National Academy of Sciences USA. 92. 7769-7773 (1995)
• [文献書誌] Naoko Kojima: "Substrate specificity of rabbit liver metalloendopeptidase and its new fluorogenic peptide substrates." Journal of Biochemistry. 118. 855-861 (1995)
• [文献書誌] Nozomu Okino: "Purification, characterization, and cDNA cloning of a 27-kDa lectin (L10) from horseshoe crab hemocytes" Journal of Biochemistry. 270. 31008-31015 (1995)
• [文献書誌] Kishan Lal Agarwala: "A cysteine protease inhibitor stored in the large granules of horseshoe crab hemocytes" Journal of Biochemistry. 119. 85-94 (1996)