T4ファージテイルリゾチームの分子構築と感染における役割

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07680712
• 研究機関: 東京工業大学
• 研究代表者: 有坂 文雄 東京工業大学, 生命理工学部, 助教授 (80133768)
• キーワード: バクテリオファージ / リゾチーム / テイルリゾチーム / 感染 / 高温失活性変異 / プロセッシング / 前駆体 / 尾部基盤

研究概要

テイルリゾチーム前駆体C末端の11残基にさらにシステインを1残基付加した計12残基の合成ペプチドを作成し、架橋試薬を用いてミオグロビンに結合した。これを完全アジュバントと混合したものを用いてウサギを免疫することによって、前駆体に特異的な抗体を作成することができた。この抗体を用いることによって、免疫電気泳動法で染まる62kDのバンドが確かにgp5前駆体であることを示すことができた。現在、解決しなければならないいくつかの問題を抱えている。ひとつは今回作成した前駆体特異的な抗体を用いて見いだされる前駆体の分子量に較べて前駆体を発現していると考えているプラスミドにコードされた酵素の分子量が若干大きいことである。同様に、成熟蛋白質と考えている1-390をコードするプラスミドを発現させたときも期待した分子量より若干大きな分子量が得られる。当初、C末端配列が間違っていると考えていたが、N末端に余分のペプチドが融合していることも考えられる。そのための、上記両蛋白質のN末端を早急に検討しなければならない。
他方、5hs(高湿失活性変異体)変異の原因が高温によるgp5のリゾチームの活性の失活によるものかどうかを調べる目的で、熱処理したものとしなかったファージ粒子をGu・HCl処理してgp5を解離させ、遊離したリゾチーム活性を測定した結果、hs株では55℃処理をすることによってリゾチーム活性が失われ、これが熱処理したhsファージ粒子が大腸菌に吸着し、尾鞘を収縮させるにもかかわらず感染できない理由であることが確認された。
上記の実験と平行して、T4リゾチームと相同性のある部分だけをクローニングし、これを発現系に組み込んだ。現在、大量発現によって調製した試料の結晶化を計画している。

研究成果

• [文献書誌] Hisayuki Morii: "Identification of Kinesin Neck Region as a Stable α-Helical Coiled-Coil and Its Thermodynamic Charcterization" Biochemistry. (in press). (1997)
• [文献書誌] Takuro Matsui: "Isolation and Characterization of a Molecular Chaperone,gp57A,of Bacteriopahge T4" J.Bacteriol.(in press).
• [文献書誌] Takayo Sasaki: "Nucleotide Sequences of the Contractile Tail Sheath and Tube Genes of Bacteriophage PS17 and Amino Aoid Sequences of Their Products" Res.Comm.Biochem.& Mol.Biol.1. 93-106 (1997)
• [文献書誌] Shuichi Kojima: "Synthesis of α-helix-forming peptides by gene engineering methods and their characterization by circular dichroism spectra measurements" Biochim.Biophys.Acta. 1294. 129-137 (1996)
• [文献書誌] Akinobu Kosukegawa: "Purification and Characterization of Virus-like Particles and Pentamers Produced by the Expression of SV40 Capsid Proteins in Insect Cells" Biochim.Biophys.Acta. 1290. 37-45 (1996)
• [文献書誌] 武田茂樹: "ネガティブ染色" 細胞工学. (6月号 印刷中)16. (1997)
• [文献書誌] 有坂文雄: "スタンダード生化学" 裳華房, 230 (1996)