|
R46プラスミド複製の大腸菌ヒストン様蛋白質依存性を形質転換効率の測定によって検定したところ、このプラスミド複製にはH-NSやStpA蛋白質は要求されないが、IHFが必須であることが分かった。しかしHU遺伝子を組み込んだプラスミドを導入してHUを過剰生産すると、IHF欠損株でもR46プラスミドの複製能が回復することが分かった。このことから、R46複製機構にはIHFによる強いDNA湾曲が必要であるがHUによるDNA超ラセン形成過程における緩やかなDNA湾曲によっても同様の効果が生じるものと考えられた。実際プラスミドDNAの超ラセン密度を測定したところ、IHF欠損株ではプラスミドの超ラセン密度に変化は見られなかったが、HU過剰生産株ではプラスミドの負超ラセン密度が増加することが分かった。つぎにR46プラスミドのIHFとHUの作用部位を同定するために制限酵素で断片化されたori領域を含む種々のサイズのDNAをクローニングしたところ、3.6Kb BglII-SmaI DNA領域にIHFとHUが作用することが分かった。コンピュータ検索を行ったところ、ori領域にはIHFが結合する可能性のきわめて高い部位が2ケ所見出された。そこでIHFによるゲルシフトアッセイを行った結果、rep遺伝子上流部位のIHF結合用塩基配列を含む領域にIHFが特異的に結合することが明らかになった。またHU欠損株でのR46の安定性をみたところ、野生株でのR46の安定性と変わり無かったことから、IHF存在下ではHUはR46の複製効率に何等寄与していないことが明らかになった。
|
