in situ RT-PCRによる脳内サイトカインの局在同定と半定量化の試み

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07680835
• 研究機関: (財)東京都神経科学総合研究所
• 研究代表者: 川添 陽子 (財)東京都神経科学総合研究所, 神経病理研究部門, 主任研究員 (60281705)
• 研究分担者: 松本 陽 (財)東京都神経科学総合研究所, 神経病理研究部門, 副参事研究員 (90173921)
• キーワード: 自己免疫性脳脊髄炎 / in situ RT-PCR / サイトカイン

研究概要

自己免疫性脳脊髄炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)を発症した中枢神経系でのミクログリアとアストロサイトの相互作用を知る目的で、in situ RT-PCRによるサイトカインmRNAを組織上で増幅・同定することを試みた。in situ PT-PCRはproteinase K処理後、SuperScript Preamplification Systemで逆転写し、さらに、TGF-β1特異的なプライマーを用いて直接法と間接法で行った。直接法ではDIG-dUDP存在下でPCRを行い、DIG標識PCR産物を抗DIG抗体を用いた免疫染色で同定した。間接法では未標識-dUDPを用いてPCRを行い、DIG標識TGF-β1特異的プローブでハイブリダイゼーションを行った。
直接法ではいくつかの前処置にもかかわらず、genomix DNAに存在するきず(nick)にDIG-dUDPが入り込んで修復され、すべての核が染色されるア-ティファクト(DNA repair artifact)が克服できなかった。一方、間接法ではこのようなア-ティファクトは認められず、EAE極期に炎症細胞とミクログリアと考えられる細胞が多数陽性となる所見が得られた。ただし、安定的に特異染色を得るにはいくつかの改良(特に増幅したPCR産物を組織に固定するための技術的改良)が必要であると思われた。

研究成果

• [文献書誌] Hirahara,H.et al.: "Long-term survival of cardiac allografts in rats treated before and after surgery with monoclonal antibody to CD2" Transplantation. 59. 85-90 (1995)
• [文献書誌] Ikarashi,Y.et al.: "Recipient-derived T cells participate in autoimmune-like hepatic lesions induced by graft-versus-host reaction." Autoimmunity. 20. 121-127 (1995)
• [文献書誌] Shin,T.et al.: "The subarachnoid space as a site for precursor T cell proliferation and effector T cell selection in experimental autoimmune encephalomyelitis." J.Neuroimmunol.56. 171-177 (1995)
• [文献書誌] Matsumoto,Y.et al.: "Characterization of CD4-DC8-TCRαβ+ T cells appearing in the subarachnoid space of rats with autoimmune encephalomyelitis." Eur.J.Immunol.26. 1328-1334 (1996)
• [文献書誌] Tanuma,N.et al.: "Pretreatment with T cell receptor peptide using conventional immunization protocol does not induce effective protection against autoimmune encephalomyelti" Cell.Immunol.168. 85-90 (1996)
• [文献書誌] Tanuma,N.et al.: "Competitive PCR quantification of pro-and anti-inflammatory cytokine mRNA in the central nervous system during autoimmune encephalomyelitis" J.Neuroimmunol.(in press).