直接PCR法による窒素固定藍藻の迅速かつ簡便な検出と評価

1995 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07750877
• 研究機関: 東京農工大学
• 研究代表者: 竹山 春子 東京農工大学, 工学部, 助手 (60262234)
• キーワード: 窒素固定藍藻 / 直接PCR / スクリーニング / nifH遺伝子

研究概要

海洋には数多くの微細藻類が存在し、その中からの有用物質生産株のスクリーニングが盛んに行われている。本研究では、特にその中でも窒素固定能を有する海洋藍藻の迅速な検出を行うことにより効率的なスクリーニングを検討した。藍藻の窒素固定はニトロゲナーゼにより行われるが、条件によっては水素を発生することも可能である。本研究の特徴としては、サンプル中に存在するターゲット藻体を直接PCR法を用いて遺伝子レベルでキャラクタライズすることによって検出する点である。ニトロゲナーゼのサブユニットである鉄タンパクをコードするnifH遺伝子を検出のマ-カとし、相補性の高いところでプライマーをデザインした。次に窒素固定藍藻を用いて、DNAを抽出することなく細胞への直接PCRを行う際の最適条件の検討を行った結果、抽出DNAを用いるときよりは低いannealing温度55°Cで良好なnifH遺伝子の増幅が確認された。また、用いる細胞数も数個単位で検出可能であることが示された。モデル実験で得られた最適条件を利用し、実海水を用いて海洋窒素固定藍藻のスクリーニングを行った。多くのサンプル中、直接PCR法でnifH遺伝子の増幅が確認されたものにおいて数種の糸状性窒素固定海洋藍藻が分離された。それらの水素生成能を調べたところ、0.49μmolH_2/mg dry wt/hと高い生成速度が示された。また、温泉源付近より得たサンプル中からも同様な方法により窒素固定藍藻が分離された。このようにサンプル中に存在する微生物を遺伝子レベルで迅速に評価することにより、多くのサンプルを一次スクリーニングにかけることが可能になり、今までにかかっていた分離操作をより簡便にかつ迅速確実に行うことが可能になった。本法はターゲット遺伝子のシークエンスさえ明らかであれば、どのような微生物にも用いることが可能であると考えられる。

研究成果

• [文献書誌] H.Takayama,et al.: "β-carotene production in a Novel Hydrogen-producing Marine Photosynthetic Bacterium Rhodovulum sulfidophilum by Cloning the Erythrobacterr longus Och101 crtI and crtY Genes." J.Mar.Biotechnol.(in press).
• [文献書誌] H.Takeyama,et al.: "DHA Enrichment of Rotifers;A Simple Two-step Culture Using the Unicellular Algae Chlorella regularis and Isochrysis galbana." J.Mar.Biotechnol.(in press).
• [文献書誌] T.Matsunaga,H.Takeyama,et al.: "Screening of Marine Cyanobacteria for High Palmitoleic Acid Productivity." FEMS Microbiol.Lett.133. 137-141 (1995)
• [文献書誌] Y.Wachi,H.Takeyama,et al.: "Screening of Melanin Biosynthesis Inhibitors from Marine Microalgae Using Streptomyces bikiniensis Bioassay." Biotechnology Techniques. 9. 633-6336 (1995)
• [文献書誌] H.Takeyama,et al.: "Application of Bacterial Magnetic Particles as Novel DNA Carriers for Ballistic Transformation of a Marine Cyanobacterium." Biotechnology Techniques. 9. 355-360 (1995)
• [文献書誌] T.Matsunaga and H.Takeyama: "Genetic Engineering in Marine Cyanobacteria." J.Appl.Phycol.7. 77-84 (1995)