微生物由来アルデヒド還元酵素による4-ハロアセト酢酸エステルの不斉還元

1995 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07760083
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 片岡 道彦 京都大学, 農学部, 助手 (90252494)
• キーワード: アルデヒド還元酵素 / 光学活性アルコール / 不斉還元 / 立体選択的反応

研究概要

AR遺伝子の大腸菌での発現 アルデヒド還元酵素(AR)をコードするcDNAを大腸菌内で発現させることを試みた。Sporobolomyces salmonicolorよりtotalRNAおよびmRNAを精製し、これらをtemplateRNAとして逆転写反応を行い、cDNAを作製した。次に、PCR法を用いて、目的とするDNA断片を増幅させ、このDNA断片を電気泳動的に分離し、オリゴヌクレオチドプローブとサザンハイブリダイズする断片を得た。さらに、この断片を制限酵素を用いて消化し、同じ制限酵素で消化したベクタープラスミドpKK223-3とライゲーションを行い、組換えプラスミドpKARを得た。この組換えプラスミドを大腸菌に形質転換し、ARの発現を行った。ARは通常用いられる濃度より低い0.1mMのIPTGの添加により充分誘導された。
ARを発現させた大腸菌を用いる4-クロロアセト酢酸エステル(CAAE)の不斉還元反応 ARを大量発現させた大腸菌の休止菌体を用いてCAAEの不斉還元反応の検討を行った。まず、還元反応に必要な添加物の検討を行ったところ、NADPH再生に必要なNADP^+、グルコース脱水素酵素、グルコースの添加が必要であった。また、水-有機溶媒2相系システムの導入を行うことにより、基質・生成物による反応阻害を回避することができ、より効率のよい(R)-4-クロロ-3-ヒドロキシブタン酸エステル(R-CHBE)への不斉還元反応を行わせることができた。最終的には、300mg/mlのCAAEから収率85%で257mg/mlのCHBEが48時間の反応で得られた。このときの生成物の光学純度は91%eeであった。

研究成果

• [文献書誌] Kataoka, M. et al.: "Optical resolution of racemic pantolactone with a novel fungal enzyme, Iactonohydrolase" Appl. Microbiol. Biotechnol.43. 974-977 (1995)
• [文献書誌] Kataoka, M. et al.: "Lactonohydrolase-catalyzed optical resolution of pantoyl lactone" Appl. Microbiol. Biotechnol.44. 333-338 (1995)
• [文献書誌] Chung, MCM. et al.: "Structural studies of a major hemorrhagin (Rhodostoxin) from the venom of calloselasma rhodostoma (Malayan pit viper)" Arch. Biochem. Biophys.325. 199-208 (1996)
• [文献書誌] Kataoka, M. et al.: "Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of aldehyde reductase from a red yeast, Sporobolomyces salmonicolor" Acta Cryst.D52(in press). (1996)
• [文献書誌] Kataoka, M. et al.: "Optical resolution of racemic pantoic acid through microbial stereoselective lactonization in two-phase system" Enzyme Microb. Technol.(in press). (1996)