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A)これまで通常の培養条件で培養したrat表皮細胞によるin vitroでのBM-CSPGを産生は蛍光抗体法で同定できなかったので、ratの培養表皮細胞を線維芽細胞を含むコラーゲンgel上で空気と培地の境界部で培養し(表皮細胞の三次元培養)、重層化した表皮細胞による基底膜部コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(BM-CSPG)産生を調べた。しかし表皮細胞によるBM-CSPG産生は蛍光抗体法では同定できなかった。培地中にTGF-βを加え、表皮細胞の三次元培養を行ったが、BM-CSPGの産生は認められなかった。今後は他のcytokineについて検討する予定である。
B)培養表皮細胞よりmRNAを抽出し、BM-CSPGのcDNAを用いてノーザンブロットを行った。蛍光抗体法によるタンパクレベルの検討では培養表皮細胞におけるBM-CSPG産生は同定されなかったが、BM-CSPGのmRNAの発現は認められた。生化学的にはimmunoblot法で表皮細胞によるBM-CSPGの産生は同定できず、現在immunoprecipitation法により検索中である。表皮細胞によるBM-CSPGの産生がmRNAレベルでは観察されるが蛍光抗体法では同定されない点に関して、BM-CSPG産生のmRNAの翻訳におけるregulation、合成されたBM-CSPGの基底膜部へのAssemblyの問題などの仮説を考え、今後の検討課題としていく予定である。
我々の使用したBM-CSPGに対する抗体はrat特異的でヒト組織は染色しなかったため、BM-CSPGに対するrabbit polyclonal抗体を作成した。しかしこの抗体はヒトの皮膚基底膜を認識するが、非特異的蛍光が強く、ヒト皮膚腫瘍組織の染色には適さなかった。
C)現在、BM-CSPGのcRNAを作成しin vivoでのBM-CSPG産生をin situ hybridization法で検討中である。
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