| 研究概要 |
脳腫瘍細胞のニトロソウレア剤に対する耐性の主因をなす0^6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT)の遺伝子発現を制御する目的で,mRNAの切断作用を有するリボザイムを作成した.対象とした遺伝子配列は,MGMTの遺伝子転写開始部位部位,第4エクソン開始部位,MGMT活性の中心をなす145番目のシステイン塩基近傍の計3カ所であり,それぞれに対する特異的配列を持つリボザイムを50〜52merのサイズで設計し,pBlueScript II のMCS(EcoR I site)に導入して in vitro transcription を行い,Rz1,Rz2,Rz3を作成した.Cell free system の実験系として,MGMT遺伝子の cDNA を組み込んだ ρKT107(Dr.Mitra より譲渡)から in vitro taranscription を行い合成したMGMT mRNA(^<32>P標識)をMgcl_2存在下で,同一モル数のRZ1,Rz2,Rz3のそれぞれと反応させたところ,37℃の条件下では120minを経過しても明瞭な切断反応は観察されなかったが,温度を60℃まで上昇させた条件下で反応させると,Rz1,Rz2,Rz3ともにMGMT mRNAに対する特異的切断反応を示し,いずれのリボザイムも反応時間に応じて効率が上昇した.現在,各リボザイム間の切断効率の差を各種条件(温度,濃度,時間,等)を変えて検討している.また,生理的条件である37℃で反応するリボザイムの設計を新たに行っており,最も切断効率の高いリボザイムが得られた段階で,MGMTが高発現している腫瘍細胞(SF-188,HeLa S3 等ニトロソウレア剤に耐性を示す細胞)に導入し,培養細胞系におけるHGMT遺伝子発現抑制によるニトロソウレア剤耐性克服の可能性について検討する予定である.
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