3本鎖DNA形成を利用したキャピラリー電気泳動によるヒト遺伝子の変異点検出

1995 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07772145
• 研究機関: 神戸薬科大学
• 研究代表者: 馬場 嘉信 神戸薬科大学, 薬学部, 講師 (30183916)
• キーワード: キャピラリー電気泳動 / 3本鎖DNA / 塩基配列 / がん遺伝子 / がん抑制遺伝子 / 変異点検出

研究概要

本研究では、ヒト遺伝子の変異点検出システムである、Triplex Affinity Captureキャピラリー電気泳動を開発し、がんの原因遺伝子をはじめとした様々なヒト遺伝子に生じた変異や多型を選択的に検出することに成功した。
1.がん遺伝子、がん抑制遺伝子をはじめ数種の疾患原因遺伝子の3本鎖DNA形成部位を含むプローブDNAを合成した。さらに、プローブDNAを蛍光ラベル化した。
2.プローブDNAをゲル中に共存させた、新規ゲルキャピラリーカラムを作製し、種々の条件下、種々の標準的なサンプルDNAの電気泳動を行ない、DNAプローブ濃度、キャピラリー温度、緩衝液のpHおよび塩濃度がその泳動挙動に大きな影響を及ぼすことを明かにした。
3.泳動条件と泳動挙動の関係を解析し、サンプルDNAの泳動時間(t)とサンプルDNAとDNAプローブとの会合定数(Ka)との間に、定量的な関係{t=t_0(1+Ka[L]_T}が成立することを実証した。
4.その関係式を基に、がん遺伝子、がん抑制遺伝子をはじめ数種の疾患原因遺伝子の3本鎖形成部位の塩基配列を識別し、変異点を検出する際の最適条件を決定した。さらに、この最適条件下において、いくつかのヒト遺伝子(インターロイキン2, p53がん抑制遺伝子)の変異あるいは多型を30分以内に検出できることを明らかにした。
以上の検討を基礎に、キャピラリー電気泳動の高速性と高分解能とを兼ね備えた高性能変異点検出システムであるTriplex Affinity Captureキャピラリー電気泳動を開発した。ここで開発した新しい方法は、がんをはじめとした様々な疾患の遺伝子診断へ応用可能である。今後は、今回検討したもの以外の疾患原因遺伝子の塩基配列を識別し、より一般的な疾患の遺伝子診断を可能にするシステムの開発を検討中である。

研究成果

• [文献書誌] Y. Baba: "Three-Dimensional Electropherogram for the Separation of DNA Restriction Fragments Using Capillary Gel Electrophoresis with a Photodiode Array Detector" J. Lig. Chromatogr.18. 1317-1324 (1995)
• [文献書誌] Y. Baba: "Rapid Typing of VNTR Locus in the human Apolipoprotein B Gene for DNA Diagnosis of Heart Disease by Polymerase Chain Reaction and Capillary Electrophoresis" Electrophoresis. 16. 1437-1440 (1995)
• [文献書誌] 馬場嘉信: "キャピラリー電気泳動によるヒト・ゲノム解析と遺伝子診断" 分析化学. 44. 883-893 (1995)
• [文献書誌] 馬場嘉信: "クロマトグラフィーの基礎知識;キャピラリー電気泳動" ぶんせき. 1995. 342-249 (1995)
• [文献書誌] Y. Baba: "Capillary Affinity Gel Electrophoresis: New Tool for Detection of the Mutation on DNA" Mol. Biotechnol.(発表予定).
• [文献書誌] 角田ちぬよ: "DNA診断へのキャピラリー電気泳動の応用" 生物物理化学. (発表予定).
• [文献書誌] Y. BAba: "Analysis of Disease-Causing Genes and DNA Based Drugs by Capillary Electrophoresis: Towards DNA Diagnosis and Gene Therapy for Human Diseases" J. Chromatogr. B. (発表予定).
• [文献書誌] 本田進: "キャピラリー電気泳動 基礎と実際" 講談社, 270 (1995)