IP_3結合蛋白質の分子デザインによる細胞内IP_3/Ca^<2+>シグナリングの解析

1995 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07780563
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 宮脇 敦史 東京大学, 医科学研究所, 助手 (80251445)
• キーワード: イノシトール三リン酸 / カルシウムチャネル / 螢光エネルギー転移 / GFP

研究概要

イノシトール三リン酸(IP3)は、細胞内セカンドメッセンジャーとして小胞体等、細胞内Ca2+プールからのCa2+動員を引き起こし、細胞外刺激に対する細胞内Ca2+動態調節に重要な役割を果たしている。IP3受容体は小胞体膜上で4量体を形成し、IP3が結合することによって開くCa2+チャンネルである。我々はIP3受容体の構造一機能相関を解析する過程で、IP3受容体単量体全長2749アミノ酸のうち、N末端側約数百アミノ酸部分がIP3結合に必要十分であることを見いだした。最近我々は、このN末端部分(IP3結合蛋白質)をcDNAから大量に調整する発現系を確立した(大腸菌、バキュロウイルス)。
このIP3結合蛋白質が、IP3結合によってどのような構造変化をおこすのかをゲル濾過法、ショ糖密度勾配遠心法を用いて調べた。蛍光ラベルしたIP3結合蛋白質の構造変化を蛍光強度の変化で検出する技術を開発し、更に細胞内への導入によって細胞内IP3濃度をリアルタイムでモニターすることを計画している。GFP蛋白質は、何らcofactorを必要とせず蛍光を発し得る為、蛍光プローブの細胞内遺伝子導入を可能にする画期的なツールである。様々な改変GFP蛋白質をスクリーニングしたところ、異なる吸収、蛍光スペクトラムを示し、蛍光エネルギー転移を可能にする幾つかの組み合わせが見つかってきた。IP3結合蛋白質のN末端、C末端にGFP蛋白質を連結させたキメラ蛋白質を作製し、現在それらの、IP3指示薬としての機能評価を行っている。

研究成果

• [文献書誌] Fujimoto, T. et al.: "Inositol 1, 4, 5-trisphosphate receptor-like protein in plasmalemmal caveolae is linked to actin filaments." J. Cell Science. 108. 7-15 (1995)
• [文献書誌] Yamamoto-Hino, M. et al.: "Immunohistochemical study of inositol 1, 4, 5-trisphosphate receptor type 3 in rat central nervous system." NeuroReport. 6. 273-276 (1995)
• [文献書誌] Yamada, M. et al.: "The calmodulin-binding domain in the mouse type 1 inositol 1, 4, 5-trisphosphate receptor." Biochem. J.308. 83-88 (1995)
• [文献書誌] Monkawa, T. et al.: "Heterotetrameric complex formation of inositol 1, 4, 5-trisphosphate receptor subunits." J. Biol. Chem.270. 14700-14704 (1995)
• [文献書誌] Miyawaki, A. et al.: "Zonal distribution of sulfotransferase for phenol in olfactory sustentacular cells." EMBOJ.(in press). (1996)
• [文献書誌] Matsumoto, M. et al.: "Ataxia and epileptic seizures in mice lacking type 1 inositol 1, 4, 5-trisphosphate receptor." Nature. 379. 168-171 (1996)
• [文献書誌] Miyawaki A. et al.: "Proceedings of the Yamada Conference XXXIX on Calcium as Cell Signal April 26-28, 1994 Tokyo, Japan" IGAKU-SHOIN, 293 (1995)