| 研究課題/領域番号 |
07807030
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| 研究種目 |
一般研究(C)
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| 研究機関 | 香川医科大学 |
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研究代表者 |
村主 節雄 香川医科大学, 医学部, 助教授 (00032897)
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| 研究分担者 |
岡本 宗裕 大阪大学, 医学部, 助手 (70177096)
原田 正和 香川医科大学, 医学部, 助手 (90127580)
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| キーワード | 寄生虫体 / 同定法 / CO1遺伝子 / 塩基配列 |
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| 研究概要 |
本年度は分子進化の面で系統樹の作成により使われており、種の同定には最も適していると思われるミトコンドリアDNA中のシトクロームCオキシダーゼサブユニット1(CO1)遺伝子の塩基配列の決定法の確立に犬糸状虫を材料としてPCR法(ポリメラーゼチエーンリアクション法)およびpT7BlueT-Vectorを用いたクローニング法を用いて成功した。先ず、凍結保存していた犬糸状虫成虫よりプロテネイゼK,SDSにて蛋白質を分解後、フェノール、クロロフォルムにて除蛋白して核酸を抽出した。この核酸を鋳型としてプラナリアのCO1遺伝子用に設計されていたプライマーであるPr-1;TGTTTTTTGTGCATCCTGAGGTTTAおよびPr-2;AGAAAGAACGTAATGAAAATGAGCAACを用いて温度条件94℃×50秒、42℃×90秒、72℃×90秒の30サイクルのPCR法を行った。このPCR産物は1%アガロース1600電気泳動により一本バンドを示したので、これをpT7Blue T-Vectorに組み込み、NovaBlueコンピテント細胞に形質転換し、LB培地にてクローン化したプラスミドを抽出し、T7promoterおよびU-19merのDye primerを用いてサイクルシークエンス反応を行った。この反応物をABI社製オートシークエンサーにより、順と逆の両方向から約439塩基の配列を読み取った。この塩基配列についてGeneBank登録のものと検索したところ、この領域のPositiveIdentityは豚蛔虫のものとは71%、Caenorhabditis elegansとは66%を、またPoisson Probabilityはそれぞれ1.6e-80と2.2e-64を示した。今後この確立された方法により出来るだけ多くの種の蠕虫類のこの領域の塩基配列を決定し、種同定法を確立すると共に分子系統樹の作成に努める。
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