| 研究課題/領域番号 |
07807128
|
|---|
| 研究種目 |
一般研究(C)
|
| 研究機関 | 東京女子医科大学 |
|---|
研究代表者 |
大貫 尚好 東京女子医科大学, 医学部, 助手 (60211108)
|
|---|
| 研究分担者 |
清水 真由美 東京女子医科大学, 医学部・第一外科学教室, 助手 (70235670)
神楽岡 治彦 東京女子医科大学, 医学部・第一外科学教室, 講師 (10177339)
|
|---|
| キーワード | 培養ヒト肺癌細胞 / パーティクル銃 / p53癌抑制遺伝子 |
|---|
| 研究概要 |
7年度の研究計画は培養ヒト肺癌細胞に対するパーティクル銃によるp53癌抑制遺伝子導入法の確立であった。
(1)ヒト肺癌細胞の採取・培養
肺癌肺切除手術にて摘出した20例の肺癌原発巣から癌細胞を採取し血清添加培地(RPMI1640)を用いて細胞培養した。このうち3例の細胞株樹立に成功した。これらの細胞株にプロテイナーゼKを加え蛋白質からDNAを解離、SDSにて蛋白質の変性、フェノール抽出、エタノール沈澱法にてDNAを抽出した。これら3例の抽出したDNAのp53癌抑制遺伝子をPCR法にて増幅し、SSCP法により電気永動することによりp53癌抑制遺伝子の変異の有無をみた。その結果3例中1例にp53癌抑制遺伝子変異が認められた。この細胞株を本実験の対象と選択した。
(2)p53癌抑制遺伝子の導入
圧力型パーティクル銃(PDS-100/Heシステム;DuPont社製)を用いて正常p53癌抑制遺伝子を、上記の変異型p53癌抑制遺伝子を持つ培養ヒト肺癌細胞に導入させる試みを行った。遺伝子発現ユニットのデザインは[promoter-GUS-正常p53癌抑制遺伝子-poly A]とした。このユニットを金粒子に付着させ圧力型パーティクル銃にて、変異型p53癌抑制遺伝子を持つ培養ヒト肺癌細胞に撃ち込んだ。導入が成功したか否かの判定はレポーター遺伝子として組み込んだβ-グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子がX-Gluc色素添加により青色に発色することにより判定している。しかし導入効率が不良でありpromoterの選択に問題があると考えて現在検討中である。
|
