| 研究概要 |
[目的]本研究は自己相関蛍光法(FCS)を用いた単一分子検出法を利用して,3重鎖DNAの形成過程の定量化を目的としている。このために蛍光標識(ロ-ダミンラベル)を行なった一本鎖オリゴTをプローブDNAとし,2重鎖DNAのホモプリン:ホモピリジン鎖をタ-ゲトとして,プローブDNAの並進拡散速度の変化から3重鎖生成過程を捉えようとすことである。本年度はFCS法を3重鎖DNAの生成過程の定量化法として確立するために、まず一本鎖DNAと2重鎖DNAそれぞれを用いて鎖長とDNAの溶液中における並進拡散速度をの関係を明かにした。
[方法]まず,光標識モノマー(Rho-dUTP)存在下においてPCR法を用いる事により,DNA鎖長をコントロールしながら,蛍光標識を導入す方法を開発した。これにより,50塩基対から7000塩基対までの様々の長さのDNAの並進拡散速度を調べる事が可能となった。また,3重鎖DNAを生成する過程のモデルとして一本鎖DNAが相補的なDNA鎖に結合し2重鎖DNAを生成する過程を解析した。
[結論]FCSで求められた2重鎖DNAの並進拡散速度はDNAを剛体棒状分子といて計算したモデルと非常に良い一致示した。このことは3重鎖DNAは溶液中においてさらに強固な構造を取ることが示唆され,次の3重鎖DNAの測定結果を解析する時の有力なモデルとなった。また,一本鎖DNAが相補的なDNA鎖に結合する時は並進拡散速度はおおよそ20倍以上に遅くなり,3重鎖DNAを用いる時でもFCS法が有効である事が示唆された。以上の研究により,FCSを用いた3重鎖DNA作用機序の基本的な戦略が確立できた。
|
