単一分子検出法による三重鎖DNAの作用機序の研究

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 07808072
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 金城 政孝 北海道大学, 電子科学研究所, 助手 (70177971)
• 研究分担者: 西村 吾朗 北海道大学, 電子科学研究所, 助手 (30218193)
• キーワード: DNA / 三重鎖 / 蛍光相関分光法 / 蛍光 / 自己相関 / ロ-ダミン / 単一分子検出 / ハイブリダイゼーション

研究概要

[目的]本研究は単一分子検出法の一つである蛍光相関分光法(Fluorescenc Correlation Spectroscopy, FCS)を用いて、溶液中での3重鎖DNAの形成機序の解明を目的とした。このために3重鎖DNAの一つのモデルとして蛍光標識(ロ-ダミン)オリゴT15DNAをプローブとし、ホモプリン:ホモピリジン鎖で形成された2重鎖DNAをターゲットとして、プローブDNAの並進拡散速度の変化から3重鎖生成過程をとらえ、それを用いて3重鎖DNA作用機序の解明を行なおうとしたものである。初年度はFCS法を3重鎖DNAの生成過程の定量化法として確立した。次年度は実際の3重鎖形成過程をFCSを用いて測定を行い、その過程を解析した。
[方法]まず、光標識モノマー(Flu-dUTP)存在下でPCR法を用いる事により、DNA鎖長をコントロールしながら、蛍光標識を導入する方法を開発した。これにより、50塩基対から7000塩基対までの様々の長さのDNAの並進拡散速度を調べる事が可能となった。また、3重鎖DNAの生成過程と比較するために蛍光標識一本鎖DNAが相補的なDNA鎖に結合し2重鎖DNAを生成する過程を解析した。
[結論]FCSで求められた2重鎖DNAの並進拡散速度はDNAを剛体棒状分子として数値計算した結果と非常に良い一致を示した。3重鎖DNAはさらに強固な構造を取ることが考えられるため、FCSを用いて3重鎖DNAの形成過程を解析できる事を明らかにした。
3重鎖DNAの生成速度は2重鎖DNAに比較して遅い事、また、2重鎖DNAでは加えたプローブDNAの全量が結合したのに対し、3重鎖DNAでは8割しか結合していないことが分かった。今後、塩基配列を変えたプローブDNAやターゲットDNAを用いてミスマッチの影響を調べて行く予定である。

研究成果

• [文献書誌] Kinjo M.: "Ultrasensitive hybridization analysis using fluorescence correlation spectroscopy." Nucleic Acid Res.23(10),. 1795-1799 (1995)
• [文献書誌] Katayama K.: "Absorbance measurement in turbid media by photon correlation method" Applied Optics. 34,. 7419-7427 (1995)
• [文献書誌] M. Wakita: "Some Characteristics of the Fluorescence Lifetime of Reduced Pyridine Nucleotides inIsolated Mitochondria, Isolated Hepatocyte, and Perfused Liver of Rat In situ," J. Biochem.(Tokyo). 118. 1151-1160 (1995)
• [文献書誌] M. Oda,: "Determination of absolute concentration of oxy-and deoxyhemoglobin in rat head by Time-Resolved Beer-Lambert Law," SPIE. 2389. 770-778 (1995)
• [文献書誌] 金城政孝: "拡散測定によるDNA構造解析-レーザー自己相関蛍光法の開発-" 日本バイオレオロジー学会誌. 第9巻. 74-83 (1995)
• [文献書誌] 金城政孝: "光を使った分子診断、相関分光法による単一分子の検出" 化学. 第50巻,. 556-559 (1995)
• [文献書誌] Nishimura G.: "Diffusing-Wave Absorption Spectroscopy in the Homegeneous Turbid Media," Opt. Commun.128,. 99-107 (1996)
• [文献書誌] Thyberg P.: "Global analysis of molecular interactions : Binding of a primer to DNA" Prog. Biophys. Molec. Biol.65. 81-81 (1996)
• [文献書誌] Nishimura G.: "Analysis of FCS data of rhodamine labled dsDNA under cleaving reaction." Prog. Biophys. Molec. Biol.65. 197-197 (1996)
• [文献書誌] Kinjo M.: "Analysis fo the munber of DNA fragment in solution using fluorescence correlation spectroscopy." Prog. Biophys. Molec. Biol.65. 197-197 (1996)
• [文献書誌] 金城政孝: "自己相関蛍光法による制限酵素断片数の評価。" 電子科学研究. 第3巻. 75-77 (1995)
• [文献書誌] 金城政孝: "遺伝子の動きを見る。" 電子科学研究. 第4巻. 96-98 (1996)