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亜鉛フィンガータンパク質は、その結合特性から人工的に新規DNA結合タンパク質をデザインする骨格として非常に優れており、人工転写因子や人工制限酵素などの応用面への研究が注目されている。しかし一方で、最も根本的な問いかけである。その標的DNAべの巻付き過程については殆ど研究が行われておらず、未だに明らかにされていない。本研究ではin vitroでは結合平衡到達に長時間を要するマルチ亜鉛フィンガータンパク質を用いることで、亜鉛フィンガータンパク質の標的DNAへの巻付き過程を解明し、得られた知見を基に新規分子設計を行うことを目的とする。
今年度は、試験管内でのマルチ亜鉛フィンガータンパク質の標的DNAへの巻付きを検証するにあたり、その巻付き過程に影響を与える細胞内タンパク質の探索を試みた。HeLa細胞の核画分、及び細胞質画分存在下における亜鉛フィンガータンパク質と標的DNAとのゲルシフト法を様々な条件下で試みたが、有意な結果は得られなかった。ゲルシフト法では、主として結合或いは非結合という二状態のみの情報しか得られないため、今後、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)や蛍光相互相関分光法(FCCS)などの手法を取り入れ、経時的な影響の探索を試みる予定である。
これと同時に、3フィンガー型人工転写因子は細胞内濃度に依らず、速やかな転写活性化パターンを示したのに対し、9フィンガー型(マルチ亜鉛フィンガー型)人工転写因子は細胞内濃度の減少に伴い、その転写活性化の開始が顕著に遅廷することを明らかとした。これは細胞内においてもマルチ亜鉛フィンガーの拳動は、結合平衡到達時間が増大するというin vitroでの実験結果が反映されることを示唆するものであり、亜鉛フィンガーモチーフの標的DNAへの結合様式を理解する上で重要な知見を提供するものであると考える。この発見に関しては、日本分子生物学会や日本薬学会で精力的に発表を行った。今後、その生物学的意義などを含め、より詳細に検討して行く予定である。
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