| 研究概要 |
DNAを位置選択的に切断する技術は、バイオテクノロジーにおいて必要不可欠である。しかし一般的な天然制限酵素は、切断可能な位置が限定、巨大なDNAに対して十分な選択性を持たない。これに対し我々はCe(IV)/EDTAとPNAを併用した人工制限酵素の構築に成功している。本系は天然を超える高い位置特異性と自由度を有するが、切断効率の面では改良の余地があった。本研究では、切断効率・選択性をより向上させた次世代の人工制限酵素の構築を目指す。
これまで、Ce(IV)/EDTAと強く相互作用する配位子(リン酸基など)をPNA末端に導入し、ターゲット部位近傍にCe(IV)/EDTAを濃縮させることで、切断効率を向上させることに成功している。そこで、より強い相互作用が期待される複数のリン酸基からなるEDTP配位子を合成し、さらなる切断効率の向上を目指した。まず設計の簡便な1本鎖切断系においてEDTP配位子を導入し評価を行い、また実際に長鎖1本鎖DNAを位置選択的に切断し、遺伝子組換えの応用を試みた。今回用いたBFP,GFP遺伝子では、蛍光発色団形成に関わるアミノ酸2残基のみが異なっているので、そこを切断のターゲットとした。基質1本鎖DNA(840mer)はBFPから、またGFPの下流を非対称PCRにより増幅した(異なるアミノ酸2残基は下流のGFP側に含む)。切断時には、従来のリン酸基に比べ非常に高い効率で切断が確認できた。相補鎖DNAを用いてBFP切断断片とGFP外来遺伝子をリガーゼにより連結した。定法に従い大腸菌にて発現させたところ、GFP由来の緑色蛍光が確認され、シークエンサーからも目的の組換え体が調製されたことが確認できた。
以上から、本系におけるEDTP配位子の有用性が実証され、本系をより高効率化する足がかりを得た。今後はさらに本系に改良を加え、ツールとしての完成を目指したいと思う。
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