| 研究分担者 |
WILHELM Scho ユスタス リービッヒ大学, 生化学・内分泌学, 教授
JEFFREY Froe 米国国立衛生研究所, 老年学研究センター, 部長 教授
POST Robert ペンシルベニア大学, 医学部, 教授
SVEN Mardh リンシェピング大学, 生命科学部, 教授
今川 敏明 北海道大学, 大学院・理学研究科, 助教授 (20142177)
嘉屋 俊二 北海道大学, 大学院・理学研究科, 助教授 (90186023)
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| 研究概要 |
1.新規に見い出したブタ胃H^+,K^+-ATPase α鎖のTyr^<10>とTyr^7の他にSer^<27>が酵素標品中のkinasesによりリン酸化されることを証明した。またSer^<27>のリン酸化が酸分泌刺激によって上昇するとされるCa^<2+>に依存することも見い出した。Ser^<27>は内因性のSer-kinaseのみならず、外部から加えたC-キナーゼ及びA-キナーゼによってもリン酸化された。これらTry及びSerのリン酸化は可逆的で内在するフォスファターゼで脱リン酸化された。リン酸化反応のCa^<2+>濃度依存性、C-キナーゼの活性化因子の効果及び抗C-キナーゼ抗体との反応性から、内因性のSer-キナーゼはC-キナーゼであると結論した。一方、Try-キナーゼをCHAPSで可溶化後、精製を試み、一次構造をcDNA側から決定することを試みている。部分精製標品の分子量はゲルろ過カラム及び活性染色の結果から、約分子量5万と推定された。Maltose binding proteinとH^+,K^+-ATPase α鎖のGly^2からGln^<111>を含むpeptide部分からなる融合蛋白とその変異蛋白を用いた実験から、上記kinasesによるvanadate存在下でのリン酸化には細胞質に存在するH^+,K^+-ATPaseα鎖のN-terminalを含む最初のsoluble domainで充分であること、又Tyr^7のリン酸化にはTyr^0のリン酸化が必須であることも示された。
2.ブタ腎Na^+,K^+-ATPaseをNa^+存在下50mM Pyridoxal 5'-diphospho-5'-adenosine (AP_2PL)で処理して得られた標品はAP_2PL probeをα鎖のLys^<480>に〜0.5/α含みNa^+に依存したATPからのEP形成能は50%に低下した。この標品をさらにfluorescein 5'-isothiocyanateで処理するとATPからのEP形成能は5%以下に低下したがacetylphosphateからのそれはほとんど影響を受けなかった。Mg^<2+>存在下のNaS_1へ種々の濃度のATPを添加すると、AP_2PL蛍光の速やかな減少後緩慢な増加が観察されたが、FITC蛍光の変化は検出されなかった。一方KE_2へNa_1と種々の濃度のATPを添加すると同様なAP_2PL蛍光の二相性の変化が生じたがFITC蛍光の変化は単相性でextentもrateも〜mM ATPで飽和した。以上の結果はLys^<480>に結合したAP_2PL probeがNa^+,K^+-ATPaseの同時に存在する各々2種類の高親和性部位と低親和性部位へのATP結合を認識することを示唆している。α鎖当たりのEP量、AP_2PL,FITC,及びOuabain結合量からNa^+,K^+-ATPaseの機能的単位は、(αβ)_2もしくは(αβ)_4と推定される。
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