微生物由来新規カルボキシルプロテアーゼの構造と機能

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08044202
• 研究機関: 京都工芸繊維大学
• 研究代表者: 小田 耕平 京都工芸繊維大学, 繊維学部, 教授 (50081584)
• 研究分担者: 平賀 和三 京都工芸繊維大学, 繊維学部, 助手 (50252549) ; 尾山 廣 京都工芸繊維大学, 繊維学部, 講師 (50221700) ; KAY John ウェールズ大学, カーディフ校分子医生物科学部, 教授 ; DUNN Ben M フロリダ大学, 医学部, 教授
• キーワード: 微生物 / カルボキシルプロテアーゼ / アスパルティックプロテアーゼ / 構造と機能 / 触媒残基 / ペプスタチン / 基質特異性 / 酸性プロテアーゼ

研究概要

原核生物由来の最初のカルボキシルプロテアーゼ(CP)であり,且つ,ぺプスタチン非感受性CPであるPseudomonas sp.(PCP)とXanthomonas sp.(XCP)の酵素を始め,Bacillus coagulans J-4 酵素,高温細菌由来CP,クマモリシンの合計4種類の酵素を対象に,これらCPの構造と機能を総合的に考察する。更に,CPの進化を考察すると共に,CPの全体像を探る。
1. 野生型酵素の解析 (実施場所:Dunn研究室)
クマモリシンを対象に新シリーズの基質を用いて速度論的解析を行い,本酵素のサブサイト構造の特徴を明らかにした。これらの成果はJ.Biochem.に投稿中。
2. 触媒残基の同定 (実施場所:小田研究室)
先にPCPとXCPの触媒残基について遺伝子工学的手法で検討し,PCPではAsp170とAsp328,XCPではAspl69とAsp348が触媒残基と推察した。今回,化学修飾法で検討しPCPのGlu80とGlu235,XCPのGlu75とGlu222などが,これらCPの基質結合に重要であることを明らかにした。
3. Baci11us sp. J-4 CP遺伝子のクローニング (実施場所:小田研究室)
本酵素遺伝子の主部分の取得に成功した。現在,上流の欠損部分について行っており,本年度中には完了予定。
4. 動物細胞を対象に新規ペプスタチン非感受性CPの検索 (実施場所:Kay研究室)
サイエンス(Vol.277)にPCP,XCPと相同性のあるプロテアーゼがヒト脳リソソームに存在し,これが遺伝病に関係することが発表された。Kay研究室において鋭意検討したが,記すべき成果は現在のところ得られていない。

研究成果

• [文献書誌] S.Narutaki: "Subsite preferences of pepstatin-insensitive carboxyl proteinases from bacteria" J.Biochem.125・1. 75-81 (1999)
• [文献書誌] M.Ito: "Identification of carboxyl residues in pepstatin-insensi-tive carboxyl proteinase from Pseudomonas sp.101 that participate in catalysis and substrate binding" J.Biochem.125・1. 210-216 (1999)
• [文献書誌] 小田耕平: "LINCL病の原因遺伝子はシュードモナスのプロテアーゼホモログ" バイオサイエンスとインダストリー. 156・12. 31-32 (1998)
• [文献書誌] M.Shibata: "Substrate specificity of pepstatin-insensitive carboxyl proteinase from Bacillus coagulans J-4" J.Biochem.124・3. 642-647 (1998)
• [文献書誌] H.Kondo: "Substrate specificities and kinetic properties of protei-nase A from Yeast Saccharomyces cerevisiae and the development of a novel substrate" J.Biochem.124・1. 141-147 (1998)
• [文献書誌] N.Oda: "Nucleotide Sequence of the gene encoding the precursor protein of pepstatin-insensitive acid protease B,Scytali-dopepsin B, from Scytalidium lignicolum" Biosci.Biotech.Biochem.62・8. 1637-1639 (1998)
• [文献書誌] M.Ito: "Substrate specificities of pepstatin-insensitive carboxyl proteinases from Gram-negative bacteria" J.Biochem.120・4. 845-850 (1996)
• [文献書誌] K.Oda: "Cloning and expression of an isovaleryl pepstatin-insensi-tive carboxyl proteinase gene from Xanthomonas sp.T-22" J.Biochem.120・3. 564-572 (1996)
• [文献書誌] T.Kakikmori: "Nucleotide sequence of the gene encoding pepstatin-insensi-tive acid protease B,Scytalidopepsin B, of Scytalidium lignicolum" Biosci.Biotech.Biochem.60・7. 1210-1211 (1996)
• [文献書誌] K.Oda: "Handbook of Proteolytic Enzymes" A.J.Barrett et al.,ed. Academic Press, 4 (1998)
• [文献書誌] K.Oda: "Aspartic Proteinases" M.James ed.,Plenum Press, New York, 5 (1998)
• [文献書誌] B.M.Dunn: "Aspartic Proteinases" M.James ed.,Plenum Press, New York, 6 (1998)