新規微生物酵素の反応機構および応用に関する研究

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08044218
• 研究機関: 富山県立大学
• 研究代表者: 浅野 泰久 富山県立大学, 工学部, 教授 (00222589)
• 研究分担者: ヘイデン ブロナ ダブリン大学, 生化学科, 博士研究員 ; アーテミュイク ピーター シェフィールド大学, 分子生物および生物工学科, 博士研究員 ; ライス デイビッド・W シェフィールド大学, 分子生物および生物工学科, 教授 ; 米田 英伸 富山県立大学, 工学部, 助手 (50285160) ; 加藤 康夫 富山県立大学, 工学部, 助教授 (20254237)
• キーワード: アミノ酸脱水素酵素 / オピン脱水素酵素 / X線結晶構造解析 / 部位特異的変異 / 遺伝子クローニング / キメラ酵素 / フェニルアラニン脱水素酵素 / メチルアスパラギン酸アンモニアリアーゼ

研究概要

(1)腸内細菌Citrobacter amalonaticus YG-1002株からメチルアスパラギン酸アンモニアリアーゼを電気泳動的に単一に精製した。本酵素をリジルエンドペプチダーゼを用いて部分消化し、ペプチド断片を得た。得られたペプチドのアミノ酸配列を決定し、DNAプローブを合成した。(2)合成遺伝子プローブを用いて、C.amalonaticus YG-1002株のゲノムDNAより同酵素遺伝子を、PCR法およびサザンハイブリダイゼーション法を用いてクローニングした。同酵素遺伝子配列の決定を行い、他酵素との相同性を比較したところ、偏性嫌気性菌であるClostridium tetanomorphum由来の同酵素と高い相同性を有していた。(3)メチルアスパラギン酸アンモニアリアーゼ及びフェニルアラニン脱水素酵素の結晶化を行うとともに、Sheffield大のRice教授研究室に送付し、X線構造解析を開始した。(4)X線構造解析の結果のフィードバックを受けて、フェニルアラニン脱水素酵素のそれぞれの酵素の活性中心と目される残基周辺に部位特異的変異をかけ、キメラ酵素を作成した。(5)国際会議において、これまでの研究成果をまとめて発表した。

研究成果

• [文献書誌] K.L.Britton: "Crystallisation of Arthrobacter sp.strain 1C opine dehydrogenase and its complex with NAD+." Acta Crystallography D. (in press).
• [文献書誌] Y.Asano: "Thermostable phenylalanine dehydrogenase from a mesophilic Microbacterium sp.strain DM-86-1" Archives of Microbiology. (in press).
• [文献書誌] Y.Kato: "3-Methylaspartate ammonia-lyase as a marker enzyme of the mesaconate pathway for (S)-glutamate fermentation in Enterobacteriaceae" Archives of Microbiology. 168. 457-463 (1997)
• [文献書誌] K.Nakamura: "Quantitation of L-amino acids by cycling between an aminotransferase and a dehydrogenase : application to the determination of L-phenylalanine in human serum" Analytical Biochemistry. 234. 19-22 (1996)
• [文献書誌] Y.Asano: "Screening for novel amino acid dehydrogenases-soil of Toyama Prefecture as a source of microorganisms-(in Japanese)" Bulletin of Toyama Prefctural University. 6. 101-106 (1996)
• [文献書誌] S.Y.K.Seah: "Alternation in substrate specificity of phenylalanine dehydrogenase by site directed mutagenesis" FEBS Letters. 370. 93-96 (1995)