ナノ光学技術による神経成長円錐の動態とシナプス形成過程の研究

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08044257
• 研究機関: 東京医科歯科大学
• 研究代表者: 片山 芳文 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 教授 (20014144)
• 研究分担者: 辰巳 仁史 名古屋大学, 医学部, 助手 (20171720) ; 古川 哲史 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 助手 (80251552) ; 平井 恵二 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 助教授 (70156628) ; MCCAIG C. D. アバディーン大学, 医学部, 上級講師 ; TSUJI S. P. & M. キュリー大学, CNRS, 教授
• キーワード: 神経細胞 / 成長円錐 / 光学技術 / 光ピンセット / 近接場光学顕微鏡 / カルシウムチャネル / 機械受容性 / 電場

研究概要

1.培養したラットDBB細胞の成長円錐に付着させたラテックビーズを、50mWの赤レーザー光ピンセットで掴み、膜面上を移動させることができた。そして、細胞体を電気刺激して成長円錐から伝達物質(アセチルコリン)が放出されると、ビーズの移動が制限された。伝達物質放出に伴って細胞膜の接着性が増したことを示唆する。
2.培養ラットDRG細胞にω-agatoxinを作用させた後、一次抗体として抗-ω-agatoxin抗体を作用させ、次いで、金コロイド(30nm)や蛍光物質を付けた二次抗体(抗-抗体)で処理することによって、ω-agatoxin感受性のCaチャンネルを免疫学的に標識できる。金コロイドで標識したチャネルが成長円錐や細胞体の表面に存在することを電子顕微鏡で観察した。
3.共焦点レーザー顕微鏡を用いて直流電場内に置いた培養DRG細胞(ラット)の成長円錐細胞内骨格(アクチン)、細胞内信号系(チロシン残基リン酸化蛋白)及び細胞核の動態を解析した。このために、3種類の蛍光プローブを用いて可視化した。電場を与えると、アクチン細胞内骨格とチロシン残基リン酸化蛋白ともに分布が非対称になり、細胞核の位置の偏位が起こった。
4.培養したラットDRG細胞の細胞体によりホールセルパッチクランプ膜電流測定を行いながら、細胞の各所に微細ガラス管先端によりコンピュータ制御された機械的刺激を行ったときの電気的応答を記録した。膜電位を-60mVに保持すると、成長円錐に加えた機械的刺激に応じて内向き電流が記録された。
5.蛍光色素DiIで染色した培養ラット海馬細胞を光近接場に置いて、DiIから発生した蛍光を冷却CCDカメラで検出・観察した。DiI染色が細胞全体で均一であることを通常の落射蛍光顕微鏡で確認した後に、全反射型の近接場光学顕微鏡で観察した。カバーガラス上に培養したにもかかわらず、DiI蛍光は細胞体の中心部および神経突起の先端部に限られ、これらの部位では、ガラス面と細胞膜が200nm以下に接近していることが分かった。

研究成果

• [文献書誌] Soeda H, Tatsumi H, Katayama Y: "Neurotransmitter release from growth cones of the dorsal root ganglion neurons in culture." Neuroscience. 77. 1187-1199 (1997)
• [文献書誌] Hirai K, Browning KN, Lees GM: "Neuropeptide Y・hyperpolarizes submucosal neurons of the guinea-pig descending colon." Neuroscience Letters. 277. 212-214 (1997)
• [文献書誌] Rajnicek AM, Macaig CD: "Giudance of CNS neurites by substratum grooves and didges; II. Effects of inhibitors of ...." Journal of Cell Science. 110. 2915-2924 (1997)
• [文献書誌] Tsuji S, Anglade P: "Hundredth anniversary of the synapse; I. Ashort history of the milestones in synapse research." Zoological Science. 14. 533-537 (1997)
• [文献書誌] FurukawaT, Ogura T, Katayama Y, HiraokaM: "Characteristica of rabbit C1C-2 expressed in Xenopus oocytes and its contribution to volume regulation." Americal Journal of Physiology. (in press). (1998)
• [文献書誌] Katayama Y, Hirai K, Morita K: "Concentration-dependent actions of a new indene derivative TN-871 in the enteric nervous system." European Journal of Pharmacology. (in press). (1998)