細菌・動物細胞間接合による癌遺伝子の伝達系の確立

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08044292
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 吉田 和夫 広島大学, 理学部, 教授 (70022720)
• 研究分担者: 西川 正信 岡山県生物科学総合研究所, 技師 (60262812) ; 竹上 勉 金沢医科大学, 総合医学研究所, 助教授 (10113490) ; KATOH Arthur 米国マーシー病院, 放射線病理癌部門, 部長
• キーワード: 細菌・動物細胞間接合 / 接合伝達 / GFP / 癌遺伝子 / ミトコンドリア / 大腸菌 / 酵母

研究概要

SV40のOriを持つ動物細胞用発現ベクターpSG5とpMANneoをもとにimcQタイプのOriTとMob遺伝子を導入した接合伝達性動物細胞用発現ベクターpBASGプラスミドを構築し、これが伝達性であることを細菌間結合により確認した。このpBASGの平滑末端化したEcoR1クローニングサイトに、プラスミドpGreen-Lantern-1のオワンクラゲ由来の緑色蛍光性蛋白質(Green Fluorescent Protein、GFP)の構築遺伝子を制限酵素Not 1で切り出し平滑末端化後、挿入結合させた新しいプラスミドpBASGreenを構築した。PFGは強力な蛍光性を持ち、特別な試薬を用いることな(475nmの光照射によりPFG遺伝子が発現している細胞を蛍光顕微鏡下で直接観察することが容易である。事実、このプラスミドを培養動物細胞COS-1やNIH3T3へ導入し強い蛍光を検出することに成功した。現在、このプラスミドにras、myc等の癌遺伝子を結合させて接合伝達の実験中である。また、接合伝達によりミトコンドリアへ遺伝子導入するプラスミドpAY-CATMの構築にも成功している。このプラスミドは細菌のクラムフェニコールトランスアセチレースの遺伝子を部位特異的突然変異によりミトコンドリア用のコドンを持つ遺伝子へ改変した遺伝子CATMを持ち、この遺伝子がパン酵母ミトコンドリアに導入されるとクロラムフェニコール耐性になることを見出した。このCATMを上述のpBASGreenに結合して動物細胞のミトコンドリアへ遺伝子導入可能なように改変中である。
研究代表者の吉田と分担者竹上は、それぞれ平成8年8月と平成9年1月に米国のDr.Katohの研究室を訪問し、研究と研究連絡を行った。Dr.Katohは平成9年2月-3月に広島大学、金沢医科大学、藤田保健衛生大学を訪問し、研究代表者、分担者と研究と研究連絡を行った。

研究成果

• [文献書誌] A.Mahmood.T.Kimura,M.Takenaka and K.Yoshida: "The construction of novel mobilizable YAC plasmids and their behavior during trans-kingdom conjugation between bacteria and yeasts" Genetic Analysis : Biomolecular Engineering. 13. 25-31 (1996)
• [文献書誌] K.Kamiji,H.Ishitomi and K.Yoshida: "A novel method of mitochondrial transformation : construction of conjugative vectors and their introduction into mitochondria by trans-kingdom conjugation" Nucleic Acids Symosium Series. 35. 205-206 (1996)
• [文献書誌] M.Nishikawa,O.Suzuki and K.Yoshida: "The ARS-independent synthesis of DNA complementary to transfer strand in a recipient yeast during trans-kindom conjugation between Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae" Nucleic Acids Symosium Series. 35. 273-274 (1996)
• [文献書誌] Y.Sawasaki,K.Inomata and K.Yoshida: "Trans-kingdom conjugation between Agrobacterium tumcfaciens and Saccharomyces cerevisiae,a bacterium and a yeast" Plant and Cell Phisiology. 37(1). 103-106 (1996)
• [文献書誌] A.Katoh,S.Breier,N.Stemmler.S.Specht.K.Blanock and F.D.Amico: "p53 protein expression in humman cancer carcinoma : lack of prognostic potential for recurrence of the disease" Anticancer Research. 16. 1301-1304 (1996)
• [文献書誌] M.Obuchi,Y.Ohara and T.Takegami: "Th iler's murine encephalomyclitis virus suogroup strain-specific infection in amurine macrophage-like cell line" Jouenal of Virology. 71(印刷中). (1997)
• [文献書誌] K.Yoshida,K.Kamiji T.Sekito,A.Mahmood and H.Ishitomi: "Intertaxionic Combination and Symbiotic Adaptation" Springer-Verlag(印刷予定), (1997)