低分子量GTP結合蛋白質Rhoとその標的蛋白質の細胞内機能の研究

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08102007
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 成宮 周 京都大学, 医学研究科, 教授 (70144350)
• 研究分担者: 石崎 敏理 京都大学, 医学研究科, 助手 (70293876)
• キーワード: 低分子量GTP結合蛋白質Rho / アクチン細胞骨格 / p160ROCK / ROCK阻害薬 / Na-H交換体 / 神経突起 / 細胞質分裂 / 蛋白質リン酸化酵素

研究概要

1.新規ピリジン誘導体Y-27632が、Rho標的蛋白質p160ROCKの特異的阻害薬であることを明らかにした。Y-27632は平滑筋弛緩薬として開発された薬物で、平滑筋のカルシウム感受性を抑制するほか、Rho依存性のストレスファイバー形成を阻害し、更に、in vivoで高血圧モデル・ラットの血圧降下を起こした。これらの結果により、p160ROCKが平滑筋のカルシウム感受性上昇のメディエーターとして働いていることが裏付けられるとともに、このメカニズムが、高血圧の病態形成に働いていることが明らかとなった。
2.p160ROCKのドミナント・アクティブ体、ドミナント・ネガティブ体及びY-27632を用いることにより、p160ROCKがRhoの下流でアゴニスト刺激時のNa^+-H^+交換体(NHE-1)の活性化に働いていることを明らかにした。p160ROCKは、in vivoでリコンビナントNHE-1をリン酸化し、in vivoのNHE-1をリン酸化はY-27632で阻害された。NHE-1活性化は細胞の伸展反応に関与することから、p160ROCKはNHE-1の活性化を介して細胞を伸展させるものと考えられる。
3.NIE-115細胞を用いて、p160ROCKがRhoの下流でアゴニストによる神経突起退縮反応に関与すること、これはミオシン軽鎖のリン酸化によるアクトミオシン化の活性化と微小管、中間経フィラメントの脱重合によることを明らかにした。また、活性化p160ROCKはこれらの細胞骨格への作用に加えて、Rac及びCdc42の機能を持続的に制御することで、突起伸展を制御することを明らかにした。
4.Rho標的蛋白質の一つ、citronにp160ROCKと相同なキナーゼ・ドメインをもつsplicing variantが存在することを見出した。このvariantは、すべての分裂細胞に存在し、分裂時に収縮溝に存在すること、その断片変異体は細胞質分裂を阻害し、多核細胞を産出することを明らかにした。Rhoは核分裂後に活性化され、細胞質分裂の開始と遂行に関与することが明らかになっており、今回の結果は、citron kinaseが細胞分裂に際のRhoのエフェクターの一つとして働いていることを示すものである。

研究成果

• [文献書誌] Uehata,M.et al: "Calcium sensitization of smooth muscle mediated by a Rho-associated protein kinase in hypertension" Nature. 389. 990-994 (1997)
• [文献書誌] Watanabe,N.et al: "p140mDia,a mammalian homologue of Drosophila diaphanous,is target protein for Rho small GTPase and is a ligand for prof 1" EMBO Journal. 16. 3044-3056 (1997)
• [文献書誌] Fujita,A.et al: "Integrin-dependent translocation of p160ROCK to cytoskeleta complex in thrombin-stimulated human platelets" Biochemical Journal. 328. 769-775 (1997)
• [文献書誌] Ishizaki,T.et al: "p160ROCK,a Rho associated coiled-coil forming protein kinase works downstream of Rho and induces focal addesions" FEBS Letters. 404. 118-124 (1997)
• [文献書誌] Hirai,A.et al: "Geranylgeranylated rho small GTPase (s) are essential for the degradation of p27kip 1 and facilitate the progression from G1 to S phase in growth-stimulated rat FRTL -5 cells" Journal of Biological Chemistry. 272. 13-16 (1997)
• [文献書誌] Altun-Gultekin,Z.F.et al: "Activation of rho-dependent cell spreading and focal adhesion biogenesis by the v-Crk adaptor protein" Molecular Cellular Biology. (in press). (1998)