低分子量GTP結合蛋白質Rhoとその標的蛋白質の細胞内機能の研究

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08102007
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 成宮 周 京都大学, 医学研究科, 教授 (70144350)
• キーワード: Rho / ROCKキナーゼ / citronキナーゼ / 細胞質分裂 / 神経突起 / がん浸潤 / がん化 / シナプス

研究概要

1. 新たなRho標的蛋白質としてcitronキナーゼを同定し、これが細胞分裂時に分裂溝に局在すること、過剰発現で細胞質分裂を惹起することを見出した。このことからcitronキナーゼは細胞質分裂におけるRhoエフェクターの一つであると推定した。
2. NIE神経芽細胞を用い刺激による突起退縮におけるRho標的蛋白質の役割を解析した。その結果、この過程がROCKキナーゼの特異的阻害薬Y-27632で阻害されること、ROCKの活性化体およびドミナント・ネガティブ体が各々突起の退縮と伸展をひきおこすこと、ネガティブ体による突起伸展はRac及びCdc42のドミナント・ネガティブ体で阻害されることを示した。このことから、神経突起の伸展と退縮がRho-ROCK経路とRac/Cdc42の経路の相互作用で制御されていることが明らかになった。
3. citronの脳内での局在をin situ hybridizationで同定し、これが視床に多く発現されていることを明らかにした。また、citronがそのC末端を介してシナプス蛋白質であるPSD95及びNMDA受容体のNR2A/Bと結合すること、これらが培養ニューロンで局在を一つにすることを明らかにした。このことがら、citoronが脳内の特異的な場所で、NMDA受容体を介するシグナル伝達に関与している可能性を明らかにした。
4. ROCKの変異体及びこれの特異的阻害薬Y-27632を用いることにより、ROCKキナーゼがLPA刺激後細胞内でRho依存性に活性化され、NHE-I蛋白質をリン酸化して、そのNa^-H^+の交換反応を活性化していることを明らかにした。
5. 同様の手法を用いて、ROCKキナーゼが肝がん細胞のin vitroの浸潤過程で働いていることを示した。また、Y-27632投与によりin vivoでの肝がん細胞の腹膜播腫が抑制されることを示し、がん細胞の転移・浸潤においてROCKキナーゼが必須であること、これの抑制ががん転移の薬物制御につながる可能性を示した。
6. 同様の手法を用いて、ROCKキナーゼがRasによる細胞の悪性化に必須の役割を果たしていること、しかし、これはSrcによる細胞のがん化には働いていないことを明らかにした。

研究成果

• [文献書誌] Madaule,P.et al.: "Role of citron kinase as a target of the small GTPase Rho in cytokinesis" Nature. 394. 491-494 (1998)
• [文献書誌] Tominaga,T.et al.: "p160ROCK mediates RhoA activation of Na-H exchange." EMBOJ.17. 4712-4722 (1998)
• [文献書誌] Hirose,M.et al.: "Molecular dissection of the Rho-associated protein kinase(p160ROCK)-regulated neurite remodeling in neuroblastoma N1E-115 cells." J.Cell Biol.141. 1625-1636 (1998)
• [文献書誌] Furuyashiki,T.et al.: "Citron,a Rho-target,interacts with PSD-95/SAP-90 at glutamatergic synapses in the thalamus." J.Neuroscience. 19. 109-118 (1999)
• [文献書誌] Itoh,K.et al.: "An essential part for Rho-associated kinase in the transcellular invasion of tumor cells." Nature Med.5. 221-225 (1999)
• [文献書誌] Sahai,E.et al.: "Transformation mediated by RhoA requires ROCK family kinase activity." Curr.Biol.9. 136-145 (1999)