シグナル伝達にかかわる蛋白質分子の細胞内における立体構造の3次元再構成

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08260204
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 片山 栄作 東京大学, 医科学研究所, 助教授 (50111505)
• キーワード: 急速凍結電子顕微鏡法 / ディープエッチレプリカ法 / イノシトール燐酸受容体 / ライアノジン受容体 / 細菌べん毛モータ / ミオシン・クロスブリッジ / 立体視差測定法 / 構造変化

研究概要

本研究は、細胞内シグナル伝達に関与する蛋白質複合体の細胞内における生理的構造および各種の機能状態におけるその構造変化を、高い時間・空間分解能をもつ急速凍結フリーズレプリカ電子顕微鏡法により捉えるとともに、新しいアルゴリズムを用いたコンピュータ画像解析によりそれらの3次元像を再構成することを目標としている。既に、細胞内Ca^<2+>-チャネルを形成することで知られるライアノジン受容体およびイノシトール3燐酸受容体(IP_3R)の高分解能のレプリカ像を得ており、これらの像から最終的な3次元像を再構成する段階に達している。しかし、初めて得られた後者の像は当初の予想よりもはるかに小さく、これまで開発したアルゴリズムを改良して更に精度を上げる必要に迫られた。そこでとりあえず、他の解析の容易な系に同じ方法を適用してその実用性を検証することにした。第1は、バクテリアべん毛モータである。細菌の内膜と外膜とを貫通するこの構造物のレプリカ像から膜の外側と内側のin situ状態における分子構築を本法により測定して大まかな立体構造を推定し、コンピュータ・グラフィクスを用いたシミュレーションを併用してその精密なモデルを提出した。次に滑り運動中のアクチン・重メロミオシン系に同様の方法を適用し、機能遂行中のイオシンクロスブリッジが3次元的にどのような構造変化を起こしているかを解析しているところである。一方、われわれがウシ小脳プルキンエ細胞の滑面小胞体上で見いだしたin situ状態のIP_3R粒子は4量体構造に由来する正方形の表面を有し、また膜内で整った2次元格子を形成していた。通常の新鮮なマウス小脳ではそのような状態の粒子は検出されないので、死後長時間氷上で放置した材料を検索したところ同様の格子が見いだされた。また、その粒子が結合する膜の裏側と思われる部位に線維状の構造物が見いだされた。受容体に結合する細胞骨格かも知れない。

研究成果

• [文献書誌] E.Katayama: "Geometry of the flagellar motor in the cytoplasmic membrane of Salmonella typhimurium as determined by stereo-photogrdmmetry of quickfreeze deop-etch replica images" Journal of Molecular Biology. 255. 458-475 (1996)
• [文献書誌] E.Katayama: "Native structure and arrangement of inositol-1,4,5-trisphosphate receptor molecules in bovine cerebellar Purkinjc cells as studied by quick-freeze deep-etch electron microscope" The EMBO Journal. 15. 4844-4851 (1996)
• [文献書誌] 片山栄作: "『膜輸送蛋白研究法の進歩と新たな展開』電子顕微鏡法" 日本臨床. 54. 718-723 (1996)
• [文献書誌] 片山栄作: "『分子のかたちを見る』電子顕微鏡による分子観察" 細胞工学. 16. 121-130 (1997)
• [文献書誌] 片山栄作: "細胞膜内におけるべん毛モータの立体構造" 生物物理. 37. 印刷中 (1997)
• [文献書誌] E.Katayama: "Current methods in muscle physiology -Advantages,problems and limitations" Oxford University Press(H.Sugi ed.)(印刷中), (1997)