転写のチェックポイントとして機能する基本転写因子TFIIEの情報認識機構の研究

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08260213
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 大熊 芳明 大阪大学, 細胞生体工学センター, 助教授 (70192515)
• 研究分担者: 花岡 文雄 大阪大学, 細胞生体工学センター, 教授 (50012670) ; 森川 耿右 生物分子工学研究所, 構造解析研究部門, 部門長 (80012665)
• キーワード: 転写 / 基本転写因子 / チェックポイント / 情報認識機構 / DNA除去修復 / TFIIE / TFIIH

研究概要

1.TFIIEの欠失変異体の調製と情報認識の際の構造一活性相関の生化学的解析
1)構造解析に用いるため、2つあるTFIIEのサブユニットを単独あるいは複合体で大腸菌にて産生させ、S-セファロース、mono-Q、phenyl HPLC等のカラムにて精製した。
2)TFIIEのTFIIEβサブユニットの欠質変異体を大腸菌にて産生させ、転写への影響や反応に関与する蛋白質との相互作用を解析した。N末端、C末端から削った変異体及び内部を欠失させた変異体を作成し、解析したところ、N末の50アミノ酸までを削っても転写活性は影響を受けず、C末から13個削ると活性は見られるが野生株の10%以下となった。次にTFIIEβがどの基本転写因子と結合するかを調ると、TFIIBとTFIIFβと強く結合したので、TFIIEβ内のこれら因子の結合領域を解析した。その結果、両者は共にC末端近傍の塩基性領域(アミノ酸257番-277番目)に結合した。
2.TFIIEの結晶化とX線構造解析による情報認識機構の検討
TFIIEの両サブユニットの精製が完了したので、現在それら全長の蛋白質を結晶化する試みを開始している。
3.TFIIHおよびIIEとDNA修復関連蛋白質の相互認識機構の研究
精製した蛋白質による無細胞DNA除去修復系を構築し、転写とカップルしたDNA除去修復の際にTFIIHとIIEがいかに情報認識を行なっているかを、精製したこれらの蛋白質を用いて生化学的に解析している。具体的には、現在までに修復因子XPC、XPGとTFIIHとの相互作用が見出された。

研究成果

• [文献書誌] Kawakami,K.et al.: "Characterization of the Core promoter of the Na^+/K^+-ATPase α1 subunit gene" Eur.J.Biochem.237. 440-446 (1996)
• [文献書誌] Kojima,S.et al.: "Transcriptional activation domain of human BTEB2,aGC box-binding factor" J.Biochem.121. 389-396 (1997)
• [文献書誌] Sugiyama,S.et al.: "Crystal Structure of PotD,the primary receptor of the polyamine transport system in Esherichia coli" J.Biol.chem.271. 9519-9525 (1996)
• [文献書誌] Kamada,K.et al.: "Structure of a replication-terminator protein complexed with DNA" Nature. 383. 598-603 (1996)
• [文献書誌] Sugasawa,K.et al.: "HHR23B,a human rad 23 homolog,stimulates XPC protein in nucleotide excision repair in vitro" Mol.Cell.Biol.16. 4852-4861 (1996)
• [文献書誌] van der Spek,P.J.et al.: "XPC and human homologs of RAD23:intracellular localization and relationship to other nucleotide excision repair complexes" Nucl.Acids Res.24. 2551-2559 (1996)