膜電位センサーとしてのカルシウム・チャネルの構造機能相関

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08268208
• 研究機関: 千葉大学
• 研究代表者: 五ノ井 透 千葉大学, 真核微生物研究センター, 助手 (30134365)
• キーワード: ATP感受性Kチャネル / スルフォニル尿素 / 内向き整流性Kチャネル / ATP / G蛋白

研究概要

1.心筋・骨格筋型のK_<ATP>チャネルが、先にクローニングしたスルフォニル尿素受容体SUR1に類似のSUR2Aと内向き整流性Kチャネルの仲間のKir6.2から構成される事を生理・薬理学的実験、およびmRNA発現の組織分布の研究等により明らかにした。
2.SUR1の構造・機能相関を調べる目的で、SUR1の2つのヌクレオチド結合領域(NBF-1と-2)にアミノ酸点突然変異を導入した。変異を持った8種のK_<ATP>チャネルをそれぞれ発現させ、パッチクランプ法、スルフォニル尿素結合実験、^<86>Rb^+流測定実験、共焦点顕微鏡観察により性質を調べた。NBF-1の変異では、蛋白の発現量、スルフォニル尿素結合量、機能的なチャネルの活性が、大きく減少した。NBF-2の変異では、UDPによるチャネル活性の増強作用が消失した。これらの結果は、2つのNBFが異なる役割を果たす事を示唆する。
3.K_<ATP>チャネルを構成するSUR1とKir6.2分子の構成比を明らかにする目的で、SUR1の後ろにKir6.2を1つ、あるいは2つ繋いだ蛋白を発現させた。^<86>Rb^+流測定、パッチクランプ法により調べた結果4つのKir6.2と4つのSUR1がチャネルを構成すると考えた。
4.SUR1とSUR2Aで構成されるK_<ATP>チャネルは、活性を阻害するATPやスルフォニル尿素の濃度、有効なチャネル開口薬の種類などが違う。これらの性質の差を決めているSURの分子内構造を探るために、SUR1とSUR2Aの分子の一部を入れ替え、^<86>Rb^+流測定実験、パッチクランプ法などによりキメラ・チャネルの性質を調べた。
5.SUR1とKir6.2およびSUR2AとKir6.2によって構成されるK_<ATP>チャネルが、G蛋白によってどのような制御を受けるか調べた。両チャネルの活性はともにGi-α1で上昇し、βγサブユニットは活性に影響を与えないことがわかった。

研究成果

• [文献書誌] Chang-Zheng Wang,et al.,: "Cloning and pharmacological characterization of a forth P2x receptor subtype widely expressed in brain and peripheral tissue including various endocrine tissues." Biochemia Biophysica Research Communication. 220. 196-202 (1996)
• [文献書誌] Nobuya Inagaki,at el.,: "A family of sulfonylurea receptors determines the pharmacological properties of ATP-sensitive K^+ channels." Neuron. 16. 1011-1017 (1996)
• [文献書誌] Noriyuki Namba,et al.,: "Kir2.2v is a negative regulator of the inward revctifying K^+ channel Kir2.2." FEBS letters. 386. 211-214 (1996)
• [文献書誌] Susumu Seino,et al.,: "Molecular biology of the β-cell ATP-sensitive K^+ channel." Diabetes Reviews. 4(2). 177-190 (1996)
• [文献書誌] 稲垣 暢也、他: "インスリン分泌の分子機構-膵β細胞K_<ATP>チャネルの構造と機能-" メディカルレビュー社, 5 (1996)
• [文献書誌] 五ノ井 透、他: "ATP感受性K^+チャネル.分子糖尿病学の進歩-基礎から臨床まで-" 金原出版, (1997)