1996 年度実績報告書

Na^+/H^+駆動型アミノ酸トランスポーターの構造・機能協関

研究課題

研究課題/領域番号	08268243
研究機関	姫路工業大学
研究代表者	平田肇姫路工業大学, 理学部, 教授 (40049052)
キーワード	アミノ酸トランスポーター / 融合タンパク質 / 大量発現 / 好熱菌 / GroEL / ES / 大腸菌
研究概要	好熱菌PS3のアラニン能動輸送体(ACP)は分子量約42.5kDaの単一ポリペプチドからなり、Na^+あるいはH^+の電気化学的ポテンシャルによって駆動されるNa^+/H^+駆動型アミノ酸(アラニン、グリシン、セリン)トランスポーターである。昨年度までに、acp遺伝子を大腸菌内で発現させることによりN末端領域についての知見が得られ、さらに、マルトース結合タンパク質(MBP)との融合タンパク質の形で大量に発現させることが可能となった。本年度はさらに(1)結晶化を目標とし生理機能を有するACP精製タンパク質の大量発現系の構築、(2) ACP相同タンパク質をコードする遺伝子のクローニング及び輸送機能の解析などについて試みた。(1)については、昨年度までに、大腸菌のマルトース結合タンパク質(MBP)発現ベクター(pMALc2)にacp遺伝子を挿入し融合タンパク質MBP-ACPとして大量発現させるようなプラスミド(pAC6268)を構築し、大腸菌TB1株で発現させる系を確立したが、この大量発現した融合タンパク質の輸送比活性は本来のACPの1%以下と低かった。そこで大量発現によって生じた不溶性タンパク質のrenaturationに用いられている大腸菌シャペロニンGroEL/ES複合体遺伝子との共発現を試み、MBP-ACPを共発現するクローンが得られた。また、(2)については、大腸菌ゲノム計画により見いだされた配列の中にACPと相同性の高いORF476が存在していることが明らかとなっているので、このORF476がアラニン輸送体としての機能をもっているかを調べるために、この遺伝子のクローニングを行い輸送機能の解析を行った。ORF476についてはすでに塩基配列が決定されているので、遺伝研小原先生よりご分与頂いたファージライブラリーからPCRを用いてクローニングし、pBR322に組み込んだプラスミドpFE476を作製し、大腸菌アラニン・グリシン輸送欠損株RM1に導入したところ輸送能の回復が見られ、ORF476もACPやA. DagAのホモログであることが明らかとなった。

研究成果

(6件)

すべてその他

すべて文献書誌 (6件)

[文献書誌] Jin, T.: "Selective Na^+ Transport through Phospholipid Bilayer Membrane by a Synthetic Calix[4]arene Carrier." Langmuir. 12. 2684-2689 (1996)
[文献書誌] Kamata, H.: "Nerve Growth Factor and Forskolin prevent H2O2-induced Apoptosis in PC12 Cells by Glutathione Independent Mechanism." Neurosci. Lett.212. 179-182 (1996)
[文献書誌] Kamata, H.: "Involvement of cellular redox state in cell survival and neuronal differentiation in PC12 cells." Biochem. Soc. Trans.24. 541- (1996)
[文献書誌] Kamata, H.: "Suppression of NGF-induced Neuronal Differentiation of PC12 Cells ; N-Acetylcysteine (NAC) uncouples the Signal Transduction from Ras to the MAP Kinase Cascade." J. Biol. Chem.271. 33018-33025 (1996)
[文献書誌] Asakura, S.: "Fibroblasts spread on immobilized fibrin monomer by mobilizing a β1-class integrin, together with a vitronectin receptor αvβ3 on their surface." J. Biol. Chem.272 (in press). (1997)
[文献書誌] 平田肇: "“生物物理から見た生命像2 生体膜-生命の基本形を形づくるもの"葛西道生、田口隆久編" 吉岡書店, 19 (1996)

1996 年度 実績報告書

Na^+/H^+駆動型アミノ酸トランスポーターの構造・機能協関

研究代表者

平田 肇 姫路工業大学, 理学部, 教授 (40049052)

研究成果

[文献書誌] Jin, T.: "Selective Na^+ Transport through Phospholipid Bilayer Membrane by a Synthetic Calix[4]arene Carrier." Langmuir. 12. 2684-2689 (1996)

[文献書誌] Kamata, H.: "Nerve Growth Factor and Forskolin prevent H2O2-induced Apoptosis in PC12 Cells by Glutathione Independent Mechanism." Neurosci. Lett.212. 179-182 (1996)

[文献書誌] Kamata, H.: "Involvement of cellular redox state in cell survival and neuronal differentiation in PC12 cells." Biochem. Soc. Trans.24. 541- (1996)

[文献書誌] Kamata, H.: "Suppression of NGF-induced Neuronal Differentiation of PC12 Cells ; N-Acetylcysteine (NAC) uncouples the Signal Transduction from Ras to the MAP Kinase Cascade." J. Biol. Chem.271. 33018-33025 (1996)

[文献書誌] Asakura, S.: "Fibroblasts spread on immobilized fibrin monomer by mobilizing a β1-class integrin, together with a vitronectin receptor αvβ3 on their surface." J. Biol. Chem.272 (in press). (1997)

[文献書誌] 平田 肇: "“生物物理から見た生命像2 生体膜-生命の基本形を形づくるもの"葛西道生、田口隆久編" 吉岡書店, 19 (1996)

1996 年度実績報告書

平田肇姫路工業大学, 理学部, 教授 (40049052)

[文献書誌] 平田肇: "“生物物理から見た生命像2 生体膜-生命の基本形を形づくるもの"葛西道生、田口隆久編" 吉岡書店, 19 (1996)