好熱イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の熱安定性

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08272229
• 研究機関: 東京薬科大学
• 研究代表者: 山岸 明彦 東京薬科大学, 生命科学部, 助教授 (50158086)
• キーワード: 蛋白質の耐熱性 / 熱安定性 / 進化分子工学 / 高度好熱菌 / イソプロピルリンゴ酸脱水素酵素 / Thermus thermophilus / Bacillus subtilis

研究概要

高度好熱菌Thermus thermophilusを宿主として、本研究者が以前に開発した好熱菌細胞内蛋白質進化系を用いて常温菌であるBacillus subtilisのイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の耐熱性を上昇させる実験を行った。野生型常温菌酵素を発現した好熱菌は酵素の耐熱性が低いためにロイシンを含まない培地中では61℃でも生育することは出来なかった。この菌株をもとに、自発的突然変異及びPCRを用いた変異導入を行うことによって生育温度の上昇した菌株を得る試みを行った結果、61℃、66℃、70℃、73℃と、次々と生育温度の上昇した菌株を得ることが出来た。これらの変異株からイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素遺伝子をク-ニングしてその塩基配列を決定したところ、それぞれの生育温度上昇変異株に置いて、T308I、I95L/T308I、I95L/M292I/T308I、T22K/I95L/M292I/T308I、とイソプロピルリンゴ酸脱水素酵素の遺伝子に順次アミノ酸置換が生じていることが見いだされた。
次いでそれぞれの遺伝子を大腸菌中で大量発現し、発現した変異酵素をクロマトグラフィーによって精製した。精製した変異酵素はいずれもKm、kcat等の酵素特性についてはほとんど変化が起きていなかった。一方それらの変異酵素の耐熱性は順次上昇していることが確認された。すなわち、それぞれの酵素の変性の中点温度は常温菌野生型が49℃であるのに対し、53℃、58℃、59℃、60℃と順次耐熱性が上昇していることが確認された。

研究成果

• [文献書誌] Okamoto,A.et al.: "An aspartate aminotransterase from an extremely thermophilic bacterium,Thermus thermophilus HB8." J.Biochem.119. 135-144 (1996)
• [文献書誌] Hayashi-Iwasaki,Y.at al.: "A Stable Intermediate in the Thermal Unfolding Process of a Chimeric 3-Isopropylalate Dehydrogenase Between a Thermophilic and a Mesophilic Enzymes." Protein Sci.5. 511-516 (1996)
• [文献書誌] Kotsuka,T.et al.: "Further Stabilization of 3-Isopropylmalate Dehydrogenase of an Extreme Thermophile,Thermus thermophilus,by a Suppress or Mutation Method." J.Bacteriol.178. 723-727 (1996)
• [文献書誌] Yamagishi,A.et al: "Pyrimidine biosynthesis genes (pyrE and pyrF) of an extreme thermophile,Thermus thermophilus." Appl.Environ.Microbiol.62. 2191-2194 (1996)
• [文献書誌] Akanuma,S.et al.: "Spontaneous tandem sequence duplications reverse the thermal stability of carboxyl-terminal modified 3-isopropylmalate dehydrogenase" J.Bacteriol.178. 6300-6304 (1996)
• [文献書誌] 山岸明彦: "進化分子工学的手法による蛋白質の耐熱化" 生物物理. 36. 144-148 (1996)