巨大ヒトゲノム導入による機能解析

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08283218
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 和田 守正 九州大学, 医学部, 助教授 (20220965)
• キーワード: 酵母人工染色体 / YAC / 機能的導入 / 発現クローニング / メチル化 / 遺伝子発現 / ABCファミリー / MDR

研究概要

本研究は巨大DNAのマニピュレーションに画期的威力を発揮できるYACテクノロジーを応用して、(1)YAC導入による機能解析、(2)導入YACの動態の解析、(3)導入効率の改善と発現クローニング法への応用を行なって、新しい側面からバイオサイエンスをサポートすることを目的とする。本年度は導入実験の対象として、ヒトMDR1遺伝子領域を用いて、以下の点について検討を加え実績を上げた。
1)YACを用いることにより、いわゆる挿入位置効果を回避できるか?:MDR1のcDNAを用いた導入実験(Ueda et al.1988)によると、薬剤耐性トランスフェクタント/Neo^rトランスフェクタントの効率は0.06%である。今回ヒトMDR1遺伝子を持つYAC導入株を単離し解析したところ、全てのクローンでヒトMDR1遺伝子が発現し、制ガン剤ビンクリスチンに耐性を獲得していた。すなわち、YACを用いることにより導入DNAの挿入位置効果を回避できる可能性が示唆された。
2)YAC導入法をどのようにシス制御機構解析に応用できるか?:導入株のいずれにおいても、導入ヒトMDR1遺伝子の増幅及び発現促進が認められたのに対し、マウスの内在性mdr遺伝子の発現、増幅は見られなかった。この選択的発現機構につきいくつかの可能性を検討した結果、DNAメチル化による制御が示唆された。5aza-CdR処理によりマウスの内在性mdr遺伝子の発現が誘導され、この可能性が確認されるとともに、YAC導入によるシス制御機構の解析の有効性が示された。
3)移入効率上昇の試み:PEGより融合効率の上昇が期待されるリポゾーム・センダイウイルスフュージョンをYAC導入に応用するために、YACのリポゾームへの封入を試みたが剪断力によるDNAの断片化が避けられなかった。線状巨大DNAは剪断力に弱いというYAC DNAの存在状態そのものを根本的に見直す必要があると考えられた。今後、移入の効率を上昇させるために、YACを環状化した後導入する方法を開発する。そのために、酵母菌内で環状化させるためのベクターを構築する。

研究成果

• [文献書誌] Hisano,T.: "Increased Expression of T-Plastin Gene in Cisplatin-Resistant Human Cancer Cells : Identification by mRNA Differential Dysplay." FEBS Letter. 397. 101-107 (1996)
• [文献書誌] Taniguchi,K.: "A human canalicular multispecific or ganic anion transporter (cMOAT) gene is overexpressed in cisplatin resistant human cancer cell lines with decreased drug accumulation." Cancer Research. 56. 4124-4129 (1996)
• [文献書誌] Taniguchi,K.: "Drug-incluced down-regulation of topoisomeraase I in human epider moid cancer cells resistant to saintopin and camptothecins." Cancer Research. 56. 2348-2354 (1996)
• [文献書誌] H.Kusaba: "Functional expression of yeast artificial chromosome (YAC)-human multidrug resistance genesin mouse cells." Genome Research. 5. 245-258 (1995)
• [文献書誌] K.Torigoe: "YAC-based 1.5 Mb contig spanning the human multidrug resistantce gene region and delineating the amplification unit in two human multidrug resistant cell lines." Genome Research. 5. 233-244 (1995)
• [文献書誌] Tatsuka,M.: "Electroporation-mediated transfection of mammalian cells with crude plasmid DNA preparations." Genetic Analysis. 12. 113-117 (1995)