内軟骨性骨形成に関与する制御因子についての分子細胞生物学的研究

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08407058
• 研究種目: 基盤研究(A)
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 加藤 幸夫 広島大学, 歯学部, 教授 (10112062)
• 研究分担者: 川嶋 芳枝 (大宅 芳枝) 広島大学, 歯学部, 教務員 (80253087) ; YAN Weiqun 広島大学, 歯学部, 助手 (80274091) ; 河本 健 広島大学, 歯学部, 助手 (50224861) ; 能城 光秀 広島大学, 歯学部, 助教授 (00144858)
• キーワード: コンドロトランスフェリン / モノクローナル / ハイブリドーマ / 軟骨細胞培 / コンカナバリンA / プロテオグリカン合成 / PTH

研究概要

1 大腸菌で全長の組み替えコンドロトランスフェリン蛋白の発現:
大腸菌で全長の組み替えコンドロトランスフェリン蛋白を発現して、これを精製した。
2 抗コンドロトランスフェリン抗体の作製:
この組み替えコンドロトランスフェリンを抗原としてELISA plateを作製することにより、抗コンドロトランスフェリンモノルロ-ナル抗体をスクリーニングして、6種類のハイブリドーマをクローニングした。そして、腹水より、Protein G-columnを用いて抗体を精製した。さらにポリクローナル抗体も4種類作製した。
3 軟骨細胞培養系での抗コンドロトランスフェリン抗体の作用:
6種類のモノクローナル抗体のなかで、mAb-2は、軟骨細胞に対するコンカナバリンAによる細胞の球形化、プロテオグリカン合成の促進を阻止した。一方、コントロール抗体は影響しなかった。
4 マウス軟骨細胞のcDNAたんライブラリーより、マウス・コンドロトランスフェリンcDNAをクローニングした。
5 コンドロトランスフェリンの合成機構:
イムノブロット法およびノーザンブロット法にて、all-tranレチノイン酸,9-cisレチノイン酸がコンドロトランスフェリンの合成を14時間以内に抑制することを見いだした。またdibutyryl cyclic AMPも長期作用させると、コンドロトランスフェリンの発現をfree-back inhibitionした(生化学会などのシンポジウムで発表予定)。
6 成長板軟骨細胞培養系で、PTHおよびPTH-rpがMMP-2,MMP-9およびMMP-3を強く誘導することが判明した(投稿中)。

研究成果

• [文献書誌] Okimura A., Makihira S., and Kato Y.: "Cartilage-matrix protein synthesis is enhanced in arthritic cartilage." Arthritis Rheum. (in press).
• [文献書誌] Yan. W. Pan H., Ishida H. Nakashima K. Suzuki F. Nishimura M., Jikko A., Oda R. and Kato Y: "Effects of concanavalin A on chondrocyte hypertrophy and matrix calcification" J. Biol. Chem.(in press).
• [文献書誌] Hashimoto k., Noshiro M. Ohno S., Kawamoto T., Satakeda H., Akazawa Y., Nakashima K., Okimura A., Ishida H., Okamoto T., Pan H., Shen M., Yan W., Kato I.: "Characterization of a cartilage-dirived 66kDa protein (RGD-CAP/big-h3) that βinds to collagen" Biochem. Biophys. Acta. (in pres).
• [文献書誌] Jikko,A., Murakami H., Yan W. Nakashima K., Ohya Y., Satakeda H., Noshiro M., Kawamoto T., Nakamura S.,Okada Y. suzuki F., and Kato Y.: "Effects of cyclic adenosine 3, 5-monophosphate on chondrocyte terminal differentiation and cartilage-matorix calcification." Endocrinology. 137. 539-551 (1996)
• [文献書誌] Jikko,A., Hiranuma H., Iwamoto M., Kato Y., Okada Y., Fuchihata H.: "Effects of X irradiation on metabolism of proteoglycans" Radiation Res.146. 93-99 (1996)
• [文献書誌] Okamoto T., Myoken Y., Yabumoto M., Osaka T., Fujita Y., Witney R. G., Kan M., Crabb J. W., Sato G. M., Kato Y., Takada K and Sato J. D.: "Androgen-dependent expression of fibroblast growth factor-1 in submaxillary grand of mouse" Biochem. Biophys. Res. Commun.221. 539-551 (1996)