緑肥植物と窒素固定菌の共生系をモデルとした共生工学のための育種研究

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08455380
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 室岡 義勝 大阪大学, 大学院・工学研究科, 教授 (60029882)
• 研究分担者: 山田 隆 広島大学, 工学部, 教授 (40230461) ; 金子 嘉信 大阪大学, 大学院・工学研究科, 助教授 (90161182)
• キーワード: 根粒形成 / 共生 / 窒素固定 / レンゲソウ / 植物遺伝子 / 根粒菌 / 共生プラスミド

研究概要

環境に負荷をかけない持続可能な食糧生産システムの開発を目指し、窒素固定細菌によるマメ科植物への根粒形成をモデルとした共生工学の構築のため、以下の研究を行った。
1. 根粒菌の共生巨大プラスミドの物理地図の作成:
レンゲソウ根粒菌、Mesorhizobium huakuii subsp.regeiの持つ共生巨大プラスミド(約350kb)上に窒素固定遺伝子群や根粒形成因子合成遺伝子群が乗っていることから、その物理的制限酵素地図の作成を目指し,巨大プラスミドをパルスフィールド電気泳動により分離した。このDNAを制限酵素処理して、superコスミドを用いてライブラリーを作成したよこのライブラリーをグループ分けし、hybridizationによりコンティグ作成を行った。現在、約300kbのコンティグが完成した。
2. 窒素固定及び根粒形成系遺伝子群の塩基配列の決定:
上記巨大プラスミドの遺伝子ライブラリーより、それぞれ両端の塩基配列を決定した。ホモロジー検索した結果,窒素固定および根粒形成因子合成遺伝子群を含む多くの遺伝子が上記コンティグ上にマッピングされた。
3. 根粒菌の形質転換系の開発:
レンゲソウ根粒菌、Mesorhizobium huakuii subsp.rengeiの形質転換系を開発するため、pBBRプラスミドを用い、エレクトロポレーション法で最適条件を求めた。その結果、10^5の効率で形質転換することが出来るようになった。
4. 形質転換根粒菌の根粒形成:
上記形質転換M.huakuii subsp.rengeiをレンゲソウの根に感染させ根粒形成を行わせた。この根粒よりプラスミドを分離したところ、pBBRを回収できたことからバクテロイド内でプラスミドが維持できることが分かった。以上の結果から、共生工学のための基礎が整いつつある。

研究成果

• [文献書誌] Makoto Fujie: "AsNODc22, a novel nodulin gene of Astragalus sinicus, encodes a protein that localizes along the cell wall of bacteria-infected cells in a nodule." Plant Cell Physiology. 39(8). 846-852 (1998)
• [文献書誌] Wanda Malek: "Competition for Astragalus sinicus root nodule infection between its native microsymbiont Rhizobium huakuii bv.renge B3 and Rhizobium sp. ACMP18 strain specific for Astragalus cicer." Applied Microbiological Biotechnology. 50. 261-265 (1998)
• [文献書誌] H.-J.Cho: "Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation and regeneration of the legume Astragalus sinicus(Chinese milk vetch)." Plant Science. 138(1). 53-65 (1998)
• [文献書誌] Hisayo Ono: "Accumulation of compatible solutes, ectoine and hydroxyectoine, in a moderate halophile, Halomonas elongata KS3 isolated from dried salty land in Thailand." Journal of Fermentation and Bioengineering. 85(4). 362-368 (1998)
• [文献書誌] Sukma Nuswantara: "Phylogenetic position of Mesorhizobium huakuii subsp.rengei,a symbiont of Astragalus sinicus cv.Japan" Journal of Bioscience and Bioengineering. 87(1). 50-56 (1999)
• [文献書誌] Hisayo Ono: "Characterization of biosynthetic enzymes for ectoine as a compatible solute in a moderately halophilic eubacteria,Halomonas elongata." Journal of Bacteriology. 181(1). 91-99 (1999)
• [文献書誌] Yoshikatsu Murooka: "Biological Nitrogen Fixation for the 21^<st> Century" eds.C.Elmerich,et al.,Kluwer Academic Publishers,London, 708 (1998)
• [文献書誌] Yoshikatsu Murooka: "Progress in Biotechnology Vol.15,Stability and Stabilization of Biocatalysts" eds.A.Ballesteros,et al.,Elsevier,Amsterdam, 757 (1998)