細菌のD-アミノ酸代謝関連酵素の阻害剤開発を目的とした構造と機能の解析

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08456052
• 研究機関: 関西大学
• 研究代表者: 左右田 健次 関西大学, 工学部, 教授 (30027023)
• 研究分担者: 江崎 信芳 京都大学, 化学研究所, 教授 (50135597) ; 老川 典夫 関西大学, 工学部, 講師 (80233005)
• キーワード: D-アミノ酸トランスアミナーゼ / アラニンラセマーゼ / ペプチドグリカン / グルタミン酸ラセマーゼ / 反応機構

研究概要

本研究では、細菌に必須なD-アミノ酸の生合成に関連するD-アミノ酸アミノトランスフェラーゼ(D-AAT)、アラニンラセマーゼ(AlaR)、グルタミン酸ラセマーゼ(GluR)の特異的阻害剤開発を目的として、これら酵素の構造と機能の関係について検討した。まず、部位特異的変異により好熱性枯草菌由来のD-AATの活性中心Arg98の役割について検討し、Arg98が基質結合部位であるとともに、D-AAT反応における基質a-ケト酸の阻害効果に関与することを明らかにした。また細菌のD-アラニン生合成に関与するアラニンラセマーゼの反応機構を明らかにするため、X線結晶解析の結果から基質a-水素の引き抜きの触媒基と予想された、補酵素ピリドキサルリン酸(PLP)結合リジン残基(K39)と、PLPを挟んでこれと反対側に位置するチロシン265(Y265A)をそれぞれアラニンに変換した、K39AおよびY265A変異酵素を作製した。K39Aはメチルアミン存在下でラセミ化反応を触媒するが、この際D-アラニンを基質にした場合にのみ基質アイソトープ効果が観察された。野生型AlaRは、D-およびL-アラニンに対して、弱いアミノ基転移活性を示すが、Y265AはL-アラニンに対してのアミノ基転移活性を失った。以上の結果、AlaR反応はK39とY265による複塩基機構によって進行し、それぞれの残基はD-およびL-アラニンからのa-水素引き抜き、および両アミノ酸が生成する際に水素を付加する触媒基であることを明らかにした。本研究ではまた、E.coli由来のGluRのUDP-N-アセチルムラミルL-アラニンによる活性化の機構や、発現調節などについても検討した。

研究成果

• [文献書誌] 吉村,徹: "D-アミノ酸の役割 生理作用と代謝をめぐって" 現代化学. 12号. 14-19 (1996)
• [文献書誌] Yoshimura,T.: "Stereospecificity for the Hydrogen Transfer and Molecular Evolution of Pyridoxal Enzymes" Biosci.Biotech.Biochem.60巻2号. 181-187 (1996)
• [文献書誌] 吉村,徹: "細菌のD-アミノ酸代謝関連酵素の構造と機能の特性" 日本農芸化学会誌. 70巻1号. 15-20 (1996)
• [文献書誌] Liu,L.: "Cloning and Expression of the Glutamate Racemase Gene of Bacillus pumilus" Journal of Biochemistry. 121巻6号. 1155-1161 (1997)
• [文献書誌] Liu,L.: "Compensation for D-Glutamate Auxotrophy of Escherichia coli WM335 by D-Amino Acid Aminotransferase Gene and Regulation of murI expression" Bioscience Biotechnology Biochemistry. 62巻1号. 193-195 (1998)
• [文献書誌] Lim,Y.-H.: "Nonstereospecific Transamination Catalyzed by Pyridoxal Phosphate-dependent Amino Acid Racemases of Broad Substrate Specificity" The Journal of Biological Chemistry. 273巻7号. 4011-4005 (1998)