変異体の選択的破壊によるミトコンドリアゲノム制御の基礎研究

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08457047
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 田中 雅嗣 名古屋大学, 医学部, 助教授 (60155166)
• 研究分担者: 米田 誠 名古屋大学, 医学部, 助手 (70270551)
• キーワード: ミトコンドリア遺伝子 / 制限酵素 / 遺伝子治療 / シグナルペプチド / 緑色蛍光蛋白質 / 融合蛋白質 / Leigh脳症 / ミトコンドリア病

研究概要

ミトコンドリア病患者の細胞においては、変異型mtDNAと正常型mtDNAが共存している。従って、変異型mtDNAのみを選択的に破壊し、正常型mtDNAを細胞内で優位に立たせれば、機能回復が期待できる。このために変異型mtDNAを切断する制限酵素をシグナルペプチドと結合させミトコンドリア内へ選択的に運び入れる。切断された変異型mtDNAは複製不能となり、正常型mtDNAが増加し、ミトコンドリア機能の回復が期待される。Leigh脳症患者から採取された線維芽細胞を骨肉腫由来のmtDNAを欠如した細胞と細胞質融合させ、8993T→G変異を有する不死化細胞系を確立した。制限酵素SmaI遺伝子をSerratiaのDNAからPCR増幅した。ラットのornitine transcarbamylase (OTC)のシグナルペプチド(sOTC)の遺伝子に制限酵素SmaI遺伝子を結合した。この融合遺伝子を哺乳類発現ベクターに挿入し発現プラスミドを得た。また,同時にsOTC-SmaIの下流にGFP(緑色蛍光蛋白質)遺伝子を結合させたプラスミドおよびsOTCに直接GFP連結したプラスミドを構築した。8993T→G変異を有するサイブリッドにsOTC-GFP融合遺伝子を持つ哺乳類発現プラスミドを導入した.蛍光顕微鏡および共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察した結果、細胞質に顆粒状に蛍光が観察され、sOTCによってGFPを選択的にミトコンドリアに移入できることを確認した。sOTC-SmaI-GFPプラスミドを導入した場合にも、蛍光強度は低いものの、細胞質に顆粒状に蛍光が観察された。sOTC-SmaI-GFPプラスミドを導入した細胞から、ネオマイシン耐性を指標として選択を行い、安定形質発現株が得られた.現在、安定形質発現株における変異mtDNAを解析中である。

研究成果

• [文献書誌] Yoritaka A: "Immunohistochemical detection of 4-hydroxynonenal protein adducts in Parkinson disease." Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 93. 2696-2701 (1996)
• [文献書誌] Onoue S: "Increase of mtDNA-binding proteins and mitochondrial mRNAs in regenerating liver." J.Surg.Res.62. 172-178 (1996)
• [文献書誌] Tanaka M: "Automated sequencing of mitochondrial DNA." Methods Enzymol.264. 407-421 (1996)
• [文献書誌] Sawano T: "Mitochondrial DNA mutations associated with the 11778 mutation in Leber's disease." Biochem.Mol.Biol.Int.38. 693-700 (1996)
• [文献書誌] Tanaka M: "Accumulation of deletions and point mutations in mitochondrial genome in degenerative diseases." Ann.NY Acad.Sci.786. 102-111 (1996)
• [文献書誌] Kovalenko SA: "Accumulation of somatic nucleotide substitutions in mitochondrial tRNA Leu (UUR) mutation encephalopathy and cardiomyopathy." Biochem.Biophys.Res.Commun.222. 201-207 (1996)
• [文献書誌] Nakamura N: "Specific detection of deleted mitochondrial DNA by in situ hybridization using a chimera probe." Biochim.Biophys.Acta. 1308. 215-221 (1996)
• [文献書誌] Islam MM: "Primary structure of the Smallest (6.4-kDa) subunit of human and bovine ubiquinol-cytochrome c reductase deduced from cDNA sequences." Biochem.Mol.Biol.Int.(in press). (1997)
• [文献書誌] Morikawa S: "Increased mitochondrial damage by lipid peroxidation in trophoblast cells of preeclamptic placentas." Biochem.Mol.Biol.Int.(in press). (1997)