変異体の選択的破壊によるミトコンドリアゲノム制御の基礎研究

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08457047
• 研究機関: (財)応用生化学研究所
• 研究代表者: 田中 雅嗣 (財)応用生化学研究所, 研究副部長 (60155166)
• 研究分担者: 米田 誠 (財)応用生化学研究所, 主任研究員 (70270551)
• キーワード: ミトコンドリア脳筋症 / F_0F_1-ATPase / 制限酵素 / シグナルペプチド / チトクロームオキシダーゼ / ミトコンドリア / 遺伝子治療 / 緑色蛍光蛋白質

研究概要

本研究では、ミトコンドリア脳筋症・心筋証において見いだされるミトコンドリアDNAの塩基番号8993のT*G塩基転換を特異的に除去することを目指した。この変異によってF_0F_1-ATPaseのATP6サブユニットにLeu*Arg置換が生じ、そのプロトンチャンネル機能に異常が生じATP合成が低下する。この変異によって制限酵素SmaIの切断部位が出現する。正常型mtDNAにはSmaIの認識配列が存在しないため、変異型mtDNAのみを特異的に破壊することが可能である。制限酵素SmaIをミトコンドリアのマトリックス酵素であるオルニチントランスカルバミラーゼのシグナルペプチドとの融合タンパク(OTC-SmaI)として合成させ、ミトコンドリア内へ選択的に輸送させた。OTC-SmaIのミトコンドリアへの輸送を確認するために緑色蛍光蛋白質(GFP)との融合蛋白質を細胞内に発現させたが、ミトコンドリアの蛍光は弱く、多くの細胞が剥離し、導入効率が低かった。発見したOTC-SmaIがミトコンドリアから核へ漏出し、核DNAを破壊するために致死的となると推定された。制限酵素EcoRIに、より強力なシグナル活性を有するCOXIV(チトクロームオキシダーゼの第4サブユニット)のシグナルを付けた融合蛋白(COXIV-EcoRI)をgalactoseプロモータの制御の下で酵母で発見させた。その発現により、ミトコンドリアDNAが消失したが、細胞毒性も強いことが明らかになった。そこで安全装置としてCOXIV-EcoRIを発現するプラスミド自身にEcoRIによる切断部位を導入した。これによって、核にEcoRIが到達した時には、プラスミド自身がEcoRIによって破壊され、COXIV-EcoRIの発現を停止させることによって、核DNAの破壊を防止できた。ミトコンドリアへの移入活性の強いシグナルの選択と発現のON/OFF制御が重要であると結論された。

研究成果

• [文献書誌] Yoritaka A: "Immunohistochemical detection of 4-hydroxynonenal protein adducts in Parkinson disease." Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 93. 2696-2701 (1996)
• [文献書誌] Onoue S: "Increase of mtDNA-binding proteins and mitochondrial mRNAs in regenerating liver." J.Surg.Res.62. 172-178 (1996)
• [文献書誌] Tanaka M: "Automated sequencing of mitochondrial DNA." Methods Enzymol.264. 407-421 (1996)
• [文献書誌] Sawano T: "Mitochondrial DNA mutations associated with the 11778 mutation in Leber′s disease." Biochem.Mol.Biol.Int.38. 693-700 (1996)
• [文献書誌] Tanaka M: "Accumulation of deletions and point mutations in mitochondrial genome in degenerative diseases." Ann.NY Acad.Sci.786. 102-111 (1996)
• [文献書誌] Kovalenko SA: "Accumulation of somatic nucleotide substitutions in mitochondrial tRNA Leu(UUR) mutation encephalopathy and cardiomyopathy." Biochem.Biophys.Res.Commun.222. 201-207 (1996)
• [文献書誌] Nakamura N: "Specific detection of deleted mitochondrial DNA by in situ hybridization using a chimera probe." Biochem.Biophys.Acta. 1308. 215-221 (1996)
• [文献書誌] Islam MM: "Primary structure of the Smallest(6.4-kDa)subunit of human and bovine ubiquinol-cytochrome c reductase deduced from cDNA sequences." Biochem.Mol.Biol.Int.41. 1109-1119 (1997)
• [文献書誌] Morikawa S: "Increases mitochondrial damage by lipid peroxidation in trophoblast cells of preeclamptic placentas." Biochem.Mol.Biol.Int.41. 767-775 (1997)
• [文献書誌] Hattori N: "Genotype in the 24-kDA subunit gene of mitochondrial complex I and susceptibility to Parkinson′s disease." Genomics. (in press). (1998)
• [文献書誌] Tanaka M: "Mitochondrial genotype associated with longevity" Lancet. 351. 185-186 (1998)
• [文献書誌] Cong J.-S.: "Mitochondrial genotype frequent in centenarians predisposes resistance to adult-onset diseases." J.Clin.Biochem.Nutr.(in press). (1998)
• [文献書誌] Zhang J: "Peroxide production and apoptosis in cultured cells carrying mtDNA mutation causing encephalomyopathy." Biochem.Mol.Biol.Int.(in press). (1998)
• [文献書誌] Yoshino H: "Postischemic accumulation of the lipid peroxidation products in the rat brain:immunohistochemical detection of 4-hydroxy-2-nonenal modified proteins." Brain Res.767. 81-86 (1997)