破傷風毒素とジフテリア毒素のキメラ毒素による標的蛋白質の生理機能解析

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08457087
• 研究機関: 甲子園大学
• 研究代表者: 松田 守弘 甲子園大学, 栄養学部, 教授 (20029771)
• 研究分担者: 杉本 央 大阪大学, 微生物病研究所, 助教授 (20142317)
• キーワード: 破傷風毒素 / ジフテリア毒素 / 毒素フラグメント / キメラ毒素 / 細胞毒性 / 毒作用

研究概要

破傷風毒素(TT)およびジフテリア毒素(DT)をHPLCなどを用いて精製、精製毒素をジチオスレイトールによる還元、4M〜2M尿素処理によって解離し、MonoQカラムを用いたFPLCなどにより単離精製した。各毒素のN末端側酵素活性フラグメントとC末端側細胞結合性フラグメントを1-エチル-3(3-L-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド-HCl(CDI)またはN-サクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネートを用いるなどして互いに置換えた複合体を作成した。各毒素を解離した後、混合したものを透析によって尿素除去、酸化させて得た再構成物をも作成した。これらの複合体の細胞毒性をVero細胞、PC12細胞を用いて、動物に対する毒作用をモルモットの皮内反応、致死毒性によって調べたところ、それぞれの毒素を解離後、混合し再構成したものは毒作用を示したが、他の複合体はほとんど毒性を示さなかった。DT酵素活性フラグメントAまたはDTを神経成長因子NGFとDCIを用いて結合した複合体の活性を調べたところ、ラットのコリン作動性神経細胞に特異的に傷害作用を示し、複合体中のDTフラグメントAは活性を保持していた。DTとTTをそれぞれ還元、尿素処理で解離した後、混合して得た再構成混合物は、Vero細胞に対する細胞毒性の増加を示したので、再構成物を精製、細胞毒性を定量的にとらえようとしている。神経分泌性PC12細胞に対して、それらの複合体は細胞毒性を示さなかったので、ノルアドレナリン開口分泌を指標として、生理活性を調べる方向に研究を進めている。また動物レベルでは上述のできるだけnativeに作成した複合体を単利精製して、DTに抵抗性を示すラット、マウスおよびDT、TTに感受性を示すモルモットを用いて致死.神経毒性を調べ、毒素フラグメントに対する抗体によるそれら毒作用の中和を調べる方向に研究を進めている。

研究成果

• [文献書誌] M. Matsuda: "Tetanus Toxin" J. Toxicol. Toxin Review.16・4. 241-252 (1997)
• [文献書誌] 松田守弘: "破傷風毒素(テタヌストキシン)" 神経精神薬理. 19・4. 221-232 (1997)
• [文献書誌] 松田守弘: "細菌外毒素とその作用機序4)破傷風毒素" 治療学. 31・12. 21-27 (1997)
• [文献書誌] 松田守弘: "細菌タンパク毒素の構造と作用およびその応用-医学的基礎研究から細胞生物学研究への応用へ-" 感染炎症免疫. 28・1. 2-18 (1998)
• [文献書誌] 松田守弘: "毒素研究の新展開-毒素の細胞生物学研究および医学への応用" 日本医事新報. (印刷中). (1998)
• [文献書誌] M. Matsuda: "Improved vaccines and treatments of tetanus to reduce tetanus deaths to zero. Biomedical Aspects of Clostridial neurotoxins," Plenum Press, New York (in press), 24 (1998)
• [文献書誌] N. Sugimoto: "Mortor neurons (tetanus and botulinum toxins), Site-Specific Neurotoxicity" Harwood Academic Publishers Gmbh (in press), (1998)