| 研究概要 |
野生型アデノ随伴ウイルス(AAV)はそのウイルスゲノムを第19番染色体AAVS1領域(19q13.3-ter)に特異的に組み込む性質を有しており、遺伝子治療用ベクターへの応用が期待されている。この部位特異的組込み反応は、AAV-Rep蛋白質とウイルスゲノム両端のITRを介するものと考えられている。そこで、RepとITRを利用したTVI(targeted vector integration)法が最近開発された。AAV-RepにはRep78,Rep68,Rep52,Rep40の4種類が存在するが、本研究ではTVI反応に関与するRepを明らかにするため、各々単独発現するプラスミドを構築し、ITRで挟んだneo^r遺伝子発現ユニットを持つベクタープラスミドと共に293細胞にトランスフェクションした。AAVS1領域への特異的組込みのアッセイ法としては、(1)AAVS1領域とITR領域の2ヶ所にプライマーを設定したPCRドットプロット法、(2)AAVS1プローブとneo^rプローブを用いたSouthern法、および(3)FISH法による分析を行った。その結果、Rep78とRep68がTVI反応に関与していることが確認できた。安定形質発現の効率はRep78を発現させた場合に高く、Rep68の効果は明瞭には認められなかった。また、Repの細胞傷害性に関する検討では、Rep78とRep68に強く認められ、Rep52,Rep40の場合は軽度であった。さらに、Rep蛋白質の部位特異的組込み活性ドメインに関して、多数のミュータントRep発現プラスミドを構築し、それぞれの組込み活性を検討した。各ミュータントRepのAAVS1領域への結合活性についてはGAGC繰り返し配列を用いたゲルシフトアッセイを行った。その結果、Arg107、Lys136、Arg138をそれぞれAlaに変換したミュータントRepではTVI活性とGAGCへの結合活性が失われた。これらの結果は、安全性が高く、大きなサイズの遺伝子を導入することが可能な染色体部位特異的遺伝子組込み法(TVI法)を確立していく上で、基礎となる重要な知見と考えられる。
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