| 研究課題/領域番号 |
08457349
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
白倉 良太 大阪大学, 医学部, 教授 (00116047)
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| 研究分担者 |
福島 教偉 大阪大学, 医学部, 助手 (30263247)
澤 芳樹 大阪大学, 医学部, 助手 (00243220)
中田 精三 大阪大学, 医学部, 助教授 (50116068)
宮川 周士 大阪大学, 医学部, 助手 (90273648)
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| キーワード | ラット / SRY遺伝子 / In Situ PCR法 |
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| 研究概要 |
本年度はラット心組織を用いた組織上での浸潤細胞の由来同定を目的として、Rat Y染色体特異的SRY遺伝子のPCR In Situ Hybridization法を確立すべく実験を行った。まずsolutionでの通常のPCRを行って、SRY遺伝子に対して合計10種類以上のPrimer setを設計し、PCRの効率及び至適条件を検索した。その結果、4種類のPrimer setでの高感度のSRY遺伝子検出が可能であった。合わせてrat Y染色体特異的繰り返し配列RN91ES8に対しても4種類のPrimer setで検討したが、何れも非特異的産物の形成が強く目的に合致した高感度の検出には不向きであった。そこで1細胞に1遺伝子と検出感度の面から技術的な困難は予想されるが、組織上でのPCR標的遺伝子をSRY遺伝子とすることに決定した。In Situ PCR法を行うには個々の組織に適した組織固定条件、Protease処理条件、PCR条件を決定する必要があるが、10%Formalin37度の条件で固定を行ったところ、16時間では固定が強すぎるために組織中のDNAが傷害されPCR signalが得られにくくなること、4時間では逆に組織固定が不十分でおそらくPCR産物が流出してしまうためにやはりPCR signalが得にくい事が明らかとなった。そこで現在8時間固定の心組織を用いてSRY DNAに対するPCR In Situ Hybridizationを検討しているが、現時点ではSignalの特異性、高いBackgroundの問題など実用までに解決されねばならない点が予想以上に多くあることが判明した。
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