| 研究概要 |
1)平成8年度と同様に、引き続き変形性股関節症患者に対する各種骨切り術や、大腿骨骨折患者および大腿骨頚部骨折患者の手術の際生ずる、本来破棄される大腿骨の骨片の海綿骨骨髄を、患者の同意を得た上で無菌的に採取し、培養を行った。
2)巨大なDNAを機械的に破砕したのち、セシウムトリフルオロ酢酸を加え、超遠心によりDNA,RAN,タンパクに分離した。
3)平成8年度に得られたRNA分画と合わせて、オリゴ(dT)セファロースカラムを使用してpoly(A)+RNAを調製し、逆転写酵素反応を行い、cDNAを作製した。そのcDNAと昨年合成した66種のオリゴヌクレオチドプライマー(C1Tアダプターとして5′-biotin-GTACATATTGTCGTTAGAACGCT-3′および5′-OH-NXYZAGCGTTCTAACGACAATATGTAC-3′を、またC1Gアダプターとして5′-biotin-GTACATATTGTC,GTTAGAACGCG-3′.および5′-OH-NXYZCGCGTTCTAACGACAATATGTAC-3′の塩基配列を用いた(NはA,C,G,Tの混合を、またXYZは可能なすべての組み合わせを表す))を用いてPCRを行い増幅したcDNAを6%変性ポリマーアクリルアミドゲルに等量ずつ電気泳動し、蛍光強度分析により数100塩基の長さのバンドについて、変形性関節症患者の骨芽細胞に特徴的な変化(バンドの濃淡)を検出した。
4)骨棘が高度な方に特異的に発現する遺伝子10数個を検出,分離し,DNAシークエンサにより増幅し,遺伝子配列を決定し,遺伝子ホモロジー検索を行った.
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